Probenvorbereitung und Bildgebung fluoreszenzmarkierter Bakterien

Zusammenfassung

Quelle: Chetrit, D., et al. Anwendung von Live-Zell-Bildgebung und Kryo-Elektronen-Tomographie zur Auflösung raumzeitlicher Merkmale des Sekretionssystems Legionella pneumophila dot/icm. J. Vis. Exp. (2020).

Dieses Video demonstriert die Herstellung und Bildgebung fluoreszierend markierter pathogener Bakterien. Agarose-Pads werden zunächst vorbereitet und in einem klebrigen Rahmen positioniert. Eine Suspension von genetisch veränderten Bakterien, die ein fluoreszierendes Protein exprimieren, wird auf das Pad aufgebracht, um die Zellen zu immobilisieren. Der Rahmen wird dann mit einem Deckzettel versiegelt und unter einem Mikroskop beobachtet, um fluoreszenzbildende Bilder von Bakterien aufzunehmen.

Protokoll

HINWEIS: Alle Verfahren, die das Wachstum, die Manipulation und Bildgebung von L. pneumophila betreffen, sollten in einem biologischen Sicherheitslabor der Stufe 2 gemäß den lokalen Richtlinien durchgeführt werden.

1. Einfügung von sfGFP in das Legionella-pneumophila-Chromosom mittels Allelaustausch und Doppelselektionsstrategie (Abbildung 1, Abbildung 2)

1. Klonen Sie folgende Sequenz in den Genersatzvektor pSR47S11: die 1.000 bp oberhalb der interessanten Stelle, dann die sfGFP-Sequenz und dann die 1.000 bp stromabwärts der interessanten Stelle (Abbildung 1). Die sfGFP-Sequenz sollte mit einem Linker, der vier bis acht Aminosäuren enthält, im Rahmen des N- oder C-Terminus-Endes platziert werden. Transformieren Sie den resultierenden Vektor in Escherichia coli DH5αλpir. Später wird L. pneumophila (der Empfänger) für einzelne Kolonien auf Holzkohle-Hefe-Extrakt (CYE)-Agar mit 100 μg/mL Streptomycin gestreift und 5 Tage bei 37 °C gewachsen (Abbildung 2).
2. Streak L. pneumophila auf CYE-agar-Streptomycin und wächst 2 Tage lang bei 37 °C (starker Fleck). Streak E. coli DH5α wurde mit pRK600-Hilfsplasmid (Helfer) auf LB-Agar mit 25 μg/mL Chloramphenicol transformiert. Streife den E. coli DH5αλpir (Spender) auf LB-Agar, der 50 μg/mL Kanamycin enthält.
3. Führen Sie eine triparentale Paarung durch: Inkubieren Sie eine Kolonie des Helfers, einer Kolonie des Spenders und des Empfängers, indem Sie Patches der drei Stämme auf einer CYE-Agarplatte ohne Selektion überlagern und 4–8 Stunden bei 37 °C brüten. Als negative Kontrollgruppe inkubieren Sie eine Helfer-Empfänger-Stamm-Mischung und eine Spender-+Empfänger-Stamm-Mischung für dieselbe Zeiträume.
4. Setzen Sie die Paarungsreaktionen in 500 μL ddH₂O. Platte 20 μL und 50 μL der Reaktionen auf CYE-Agar mit 100 μg/mL Streptomycin und 10 μg/mL Kanamycin und wachsen Sie 5 Tage lang bei 37 °C. Streaken Sie vier der resultierenden Klone auf CYE-Agar mit 100 μg/mL Streptomycin und wachsen 5 Tage lang bei 37 °C.
5. Streak 16 Klone auf CYE-Agar, der 5 % Saccharose und 100 μg/mL Streptomycin enthält, und wächst 5 Tage lang bei 37 °C. Anschließend werden 32 dieser Klone auf CYE-Agar mit 100 μg/mL Streptomycin und auf CYE-Agar mit 100 μg/mL Streptomycin und 10 μg/mL Kanamycin gestreakt und 5 Tage lang bei 37 °C gewachsen.

2. Isolierung von Klonen, die sfGFP in das L. pneumophila-Chromosom integriert haben

1. Streak-Klone, die auf CYE-agar-Streptomycinplatten empfindlich auf Kanamycin reagierten, bestätigen mit der Kolonie-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) die Einschleusung von sfGFP in das Chromosom. Verwenden Sie Primer, die komplementär zum sfGFP-Gen und zur interessierenden chromosomalen Region sind, um die Insertionsverbindung zu amplifizieren.
   1. Mischen Sie 0,5 μL jeder der 10 μM großen Primer-Lösungen und eine Kolonie zu einem Endvolumen von 12,5 μL und denaturieren Sie sie für 10 Minuten bei 95 °C. Kühlen Sie 10 Minuten auf Eis, fügen Sie 12,5 μL 2x PCR-Mastermischungslösung hinzu und führen Sie eine PCR-Analyse durch.
2. Wachsen Sie für 2 Tage starke Flecken der isolierten Kolonien auf CYE-agar-Streptomycinplatten bei 37 °C. Untersuchen Sie die Expressionsniveaus und die Stabilität der sfGFP-Fusionen durch Immunoblotting mit einem Anti-GFP-Antikörper.

3. Lebendzellbildgebung von L. pneumophila mit fluoreszierend markierten Dot/ICM-Komponenten

1. Herstellung von Agarose-Pads
   1. Stellen Sie etwa 30 ml einer 1 % schmelzarmen Agaroselösung in Wasser her. Etwa 90 Sekunden in einer Glasflasche in der Mikrowelle auftreiben, gelegentlich kreisen, bis die Agarose vollständig aufgelöst ist.
   2. Platziere zwei 22 x 22 x 0,15 mm große 3-Glas-Objektträger an den Rand eines 25 x 75 x 1,1 mm großen^{3-Glas-Objektträgers}, einer übereinander. Stapeln Sie zwei weitere 22 x 22 x 0,15 mm große³ Glasobjekte an der anderen Kante.
   3. Pipettieren Sie etwa 1 ml der geschmolzenen Agarose in die mittlere Rutsche zwischen den beiden oberen Glasträgern und setzen Sie dann einen weiteren 25 x 75 x 1,1 mm^{großen 3-Objektträger} auf die geschmolzene Agarose. Versuche, die Bildung von Luftblasen zu vermeiden. Kühlen Sie die Folien 15 Minuten bei 4 °C ab.
   4. Mit einem Skalpell oder Rasiermesser schneiden Sie das Pad vorsichtig in kleine Quadrate von ~5 x 5 mm². Befestigen Sie einen doppelseitigen Klebekörper von 17 x 28 x 0,25 mm^{und 3} mm auf einem 25 x 75 x 1,1 mm großen 3-Glas-Schlitten und legen Sie mehrere Polster auf den Schlitten.
2. Bildaufnahme
   HINWEIS: Die folgenden Schritte werden für ein Mikroskop beschrieben, das unter der Kontrolle des SlideBook 6.0 steht und mit Festleiterbeleuchtungen, einer CCD-Schwarzweißkamera und einem 100-fachen Objektivobjektiv (1,4 Ziffernblende) ausgestattet ist. Falls erforderlich, verwenden Sie alternative Mikroskopiegeräte mit geeigneten Hardware- und Softwarekonfigurationen, die je nach Protokolleinstellung angepasst werden können.
   1. Lösen Sie einen schweren Fleck von L. pneumophila in 1 ml ddH₂O auf, Wirbel und pipieren Sie 2–3 μL der Verdünnung auf die Pads. Legen Sie vorsichtig einen 50 x 24 x 0,15 mm großen 3-Deckel über den Kleberahmen.
   2. Im Capture-Fenster stellen Sie den ND auf 180 Grad ein. Stellen Sie das Binning auf 2ײ ein und verwenden Sie den 488-nm-Kanal, um die Probe zwischen 500–1.000 ms zu belichten. Validieren Sie die Spezifität des Fluoreszenzsignals durch Bildgebung von unmarkierten L. pneumophila mit denselben Parametern (Abbildung 3).

Ergebnisse

Abbildung 1: Schematische Übersicht der homologen Rekombination und des allelischen Austauschs, mit dem sfGFP in das L. pneumophila-Chromosom eingesetzt wird . (A) Die triparentale Paarung wurde zwischen ei...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
100x Plan Apo-Ziel (1,4 NA)	Nikon
ASSE	Sigma-Aldrich	A9758
Aktivkohle	Sigma-Aldrich	C5510
Agarose GPG/LMP, niedriger Schmelz	Amerikanische Bioanalytiker	AB00981
Bacto dehydrierter Agar	BD	214010
Genrahmen, 1,7x2,8 cm, 125 μL	Fisher Scientific	AB-0578
L-Cystein	Sigma-Aldrich	C7352
Mikroskopabdeckungen 22x22 mm	Fisher Scientific	12-542B
Mikroskopabdeckungen 24x50 mm	Fisher Scientific	12-545K
Mikroskopobjektträger 25x75x1 mm	Globe Scientific	1380
SlideBook 6.0	Innovationen in der intelligenten Bildgebung
Spectra X Lichtmotor	Lumencor
Taq 2X Master Mix	New England BioLabs	M0270
Titan Krios	Thermo Fisher Scientific
Hefeextrakt	BD	212750