Etablierung eines Mausmodells der Clostridium difficile-Infektion

Zusammenfassung

Quelle: Winston, J. A. et al. Cefoperazon-behandeltes Mausmodell des klinisch relevanten Clostridium difficile Stamms R20291. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video demonstriert das Verfahren zur Inokulation von antibiotika-vorbehandelten Mäusen mit Clostridium difficile-Sporen , um ein murines Infektionsmodell zur Untersuchung von Pathogenese und Wirtsreaktionen zu etablieren.

Protokoll

Alle Verfahren, die Tiermodelle betreffen, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem JoVE veterinärmedizinischen Überprüfungsausschuss überprüft.

1. Herstellung des Clostridium difficile Sporeninokulums und des oralen Gavage der Mäuse

HINWEIS: Mäuse mit C. difficile-Sporen sollten in einer Biosicherheits-Tieranlage der Stufe 2 untergebracht werden.

1. Erhalten Sie einen C. difficile-Sporenbestand des gewünschten Stamms (in diesem Fall R20291), der in sterilem Wasser vorbereitet und bei 4 °C gelagert wurde. Bestimmen Sie vor der Verwendung die Zählung dieses Sporenbestands.
2. Basierend auf der bekannten Konzentration (Sporen/ml) des Sporenbestands berechnet man die gewünschte Verdünnung, um 10⁵ Sporen pro 25 μl zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass das Inokulumvolumen ausreichend ist, um alle Mäuse im Experiment zu impfen (25 μl pro Maus), die Aufzählung des Inokulums durchzuführen (ca. 30 μl) und den Pipettierungsfehler zu berücksichtigen.
3. Vortex der ursprüngliche C. difficile-Sporenstamm . Anschließend wird das berechnete Volumen (ab Schritt 1.2) des ursprünglichen C. difficile-Sporenstamms in sterilem Wasser innerhalb eines schraubverschlossenen Mikrozentrifugenrohrs wieder suspendiert. Führen Sie dies aerobisch in einer laminaren Strömungshaube durch. Identifizieren Sie diese verdünnte Mischung als das "Sporeninokulum".
4. Geben Sie das Sporeninokulum in ein 65 °C starkes Wasserbad und erhitzen Sie es 20 Minuten lang.
   HINWEIS: Dieser Schritt stellt sicher, dass nach der Wärmebehandlung nur noch aktive C. difficile-Sporen übrig bleiben.
5. Innerhalb der laminaren Flusshaube nehmen Sie 50 μl erhitztes Sporeninokulum, legen es in ein steriles Mikrozentrifugenrohr und leiten Sie es in die anaerobe Kammer. Verwenden Sie diese Probe zur Sporenaufzählung.
6. Innerhalb der laminaren Flusshaube wird das verbleibende erhitzte Sporeninokulum in eine 1-ml-Spritze geladen, die an einer sterilen, bulbförmigen Magengagenadel befestigt ist. Verwenden Sie einen manuellen Spritzen-Stepper, um eine genaue und schnelle Wiederholung der Dosierung zwischen Mäusen sicherzustellen. Stellen Sie sicher, dass die Streunadel vor der Anwendung mit dem erhitzten Sporeninokulum gefüllt ist.
   HINWEIS: Für jede Maus ist keine neue sterile Wandnadel erforderlich. Wenn jedoch verschiedene Dosen von C. difficile-Sporen verabreicht werden, wird für jede Dosis eine neue Gavage-Nadel empfohlen.
   HINWEIS: C. difficile-Sporen sind hochresistent gegen herkömmliche Desinfektionsmittel. Daher ist der Einsatz eines sporizidalen Desinfektionsmittels, wie zum Beispiel #62 Perisept Sporicidal Desinfektionsmittel, notwendig. Der Hersteller empfiehlt eine Kontaktzeit von 2 Minuten, um C. difficile-Sporen zu zerstören.
7. Jede Maus mit 25 μl des Sporeninokulums abgeben. Fesseln Sie jede Maus sanft, indem Sie das Tier an der lockeren Haut am Hals und Rücken greifen, um den Kopf zu lähmen. Mit dem Zeigefinger wird der Kopf des Tieres weiter immobilisiert und die Speiseröhre verlängert. Stellen Sie sicher, dass das Tier während der Fixierung keine Laute von sich gibt oder andere Anzeichen von Stress zeigt.
   HINWEIS: Das durch Gavage gegebene Gesamtvolumen der Mäuse darf 10 ml/kg Körpergewicht (0,1 ml/10 g) nicht überschreiten.
8. Halten Sie die Maus in einer aufrechten, vertikalen Position und führen Sie die Gavage-Nadel vorsichtig in die Seite des Mundes. Richte die Gavage-Nadel entlang des Gaumens und führe die Gavage-Nadel langsam in die Speiseröhre.
   HINWEIS: Wenn Widerstand auftritt, könnte die Schenknadel in die Luftröhre eindringen und sollte daher NICHT vorgeschoben, sondern entfernt und sofort neu positioniert werden.
9. Nachdem die Gavage-Nadel etwa halb in der Speiseröhre eingedrungen ist, injizieren Sie 25 μl des erhitzten Sporeninokulums und ziehen Sie die Gavage-Nadel vorsichtig aus der Speiseröhre.
   HINWEIS: Ein kraftvolles Vorschieben der Gavage-Nadel kann zum Riss der Speiseröhre oder des Magens führen. Daher ist es am besten, die Gavage-Nadel beim Vorrücken der Gavage-Nadel zu entfernen und neu zu positionieren.
10. Bringen Sie das Tier zurück in den Käfig und beobachten Sie es auf Husten oder Anzeichen von Atemnot, da dies auf eine unbeabsichtigte Trachealgabe oder Aspiration des erhitzten Sporen-Inokulums hindeuten kann.
    HINWEIS: Mäuse sind nach einer Antibiotikabehandlung extrem anfällig für C. difficile ; Daher sind Vorsichtsmaßnahmen zur Verhinderung von Kreuzkontamination zwischen den Fäusten unerlässlich. Dies ist besonders wichtig bei der Kontrollkontrolle von antibiotikabehandelten, aber ungehinderten Mäusen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
#62 Perisept Sporidizial-Desinfektionsreiniger	SSS Navigator	48027	Dieses Produkt muss gemäß der Empfehlung des Herstellers verdünnt werden
C57BL/6J-Mäuse	Das Jackson-Labor	664	Mäuse sollten 5 bis 8 Wochen alt sein
2 ml Mikro-Zentrifugenschraubkappe	Corning	430917