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Alle Verfahren, die Tiermodelle betreffen, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem JoVE veterinärmedizinischen Überprüfungsausschuss überprüft.
- Entnahme von Proben für die Clostridium difficile (C. difficile) Aufzählung
HINWEIS: Vor der Erfassung von Fäkalien oder Mücegehalt wiegen Sie sterile Mikrozentrifugenröhrchen auf einer analytischen Waage. Tragen Sie das Röhrengewicht an der Seite des Rohrs auf, runden Sie auf vier Dezimalstellen (z. B. 0,9864 g). Bezeichnen Sie dieses Gewicht als das "Rohrgewicht". Jede entnommene Probe sollte in ein steriles, gewichtetes Mikrozentrifugenrohr gelegt werden.
1. Sterile Sammlung von Mäusekot- Fesseln Sie jede Maus sanft, indem Sie das Tier an der losen Haut am Hals und Rücken greifen, um den Kopf zu immobilisieren. Benutzen Sie den kleinen Finger, um den Schwanz des Tieres vorsichtig zu fixieren und so den After freizulegen. Stellen Sie sicher, dass das Tier während der Fixierung keine Laute von sich gibt oder andere Anzeichen von Stress zeigt.
- Halten Sie ein steriles, gewichtetes Mikrozentrifugenrohr direkt unter dem Anus des Tieres. Es ist unerlässlich, dass das Rohr keinen direkten Kontakt mit der Maus hat.
- Während das Tier kotet, sammelt das Kotpellet in das Rohr. Halten Sie das Rohr bei Raumtemperatur, bis alle Kotproben entnommen sind. Es kann mehrere Minuten dauern, bis eine Maus, was wiederholte Versuche zur Erfassung von Kot erforderlich macht.
- Wiegen Sie die Röhren mit Kot auf der analytischen Waage. Trage das Röhrengewicht auf, runden Sie auf vier Dezimalstellen (z. B. 1,0021 g). Geben Sie das erhaltene Gewicht als "Endrohrgewicht" an.
- Geben Sie die Kotproben direkt nach der Stuhlentnahme in die anaerobe Kammer zur bakteriellen Erhebung.
- Bakterielle Enumeration von C. difficile
- Berechnen Sie das Endgewicht des Inhalts (Fäkalien), der für C. difficile aufgezählt wird. Dies wurde durchgeführt, indem das "Endrohrgewicht" vom "Rohrgewicht" abgezogen wurde.
- Berechnen Sie eine 1:10-Verdünnung des Inhalts zu 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und suspendieren Sie entsprechend. Für Fäkalpellets verwenden Sie die Spitze der Pipette, um die Kugel vorsichtig in Lösung zu bringen.
- Inkubieren Sie diese resuspendierten Proben anaerob bei Raumtemperatur für 30 Minuten, damit der Inhalt absinken kann.
- Führen Sie serielle Verdünnungen für jede Probe in 1x PBS durch, um die koloniebildenden Einheiten (CFU) pro g Gehalt (Fäkalien) aufzuzählen. Führen Sie dies anaerob aus.
- Mit aseptischer Technik werden 100 μl jeder seriellen Verdünnung auf Taurocholat-Cycloserin-Cefoxitin-Fructose-Agarplatten (TCCFA) übertragen. Mit einem sterilen L-förmigen Streuer wird die aufgetragene Verdünnung auf das Medium verteilt, um sie gleichmäßig über die Platte zu verteilen. Für eine genaue Aufzählung der Kolonien ist eine genaue Verteilung der Verdünnung unerlässlich.
- Inkubieren Sie die Platten anaerob für 24 Stunden bei 37 °C. Zu diesem Zeitpunkt werden C. difficile-Kolonien aufgezählt, um den CFU pro g Inhalt (Kot) zu erhalten. C. difficile-Kolonien sind flach und blassgelb und haben unregelmäßige Ränder sowie ein gepflegtes Glas-Aussehen.
HINWEIS: Dieses Protokoll kann verwendet werden, um C. difficile von anderen murinen gastrointestinalen (GI) Inhalten, einschließlich ilealem und kolonischem Inhalt, aufzuzählen. Polymerase-Kettenreaktionsplatten (PCR) können für serielle Verdünnungen verwendet werden.