Fluoreszenzbasierter Assay zur Untersuchung von Makrophagenrezeptor-Interaktionen mit bakteriellen Antigenen

Zusammenfassung

Quelle: Barbero, A. M., et.al. Fluoreszenztests zur Untersuchung der Wechselwirkung von Mycobacterium tuberculosis mit dem Immunrezeptor SLAMF1. J. Vis. Exp. ( (2025)

Dieses Video demonstriert einen fluoreszenzbasierten Test zur Untersuchung der Wechselwirkung zwischen einem Makrophagerezeptor und Mycobacterium tuberculosis-Antigenen . Fluoreszierend markierte Antigene auf einem Deckzettel werden mit Makrophagen-Proteinextrakten inkubiert, vernetzt, mit Antikörpern markiert und durch überlappende Fluoreszenzsignale visualisiert.

Protokoll

1. Mycobacterium tuberculosis – SLAMF1-Wechselwirkung mittels Fluoreszenzmikroskopie

1. Bakterien-Protein-Vernetzung
   1. Führen Sie 12-mm-runde Deckschichten mit einer rundnasigen chirurgischen Pinzette in 24-Bohrloch-Kulturplatten (1 Deckschicht pro Bohrloch) ein.
      HINWEIS: Reinigen Sie die Überdeckfolien gründlich mit 70 % Ethanol. Bei Wunsch können sie autoklaviert oder 30 Minuten lang unter UV-Licht sterilisiert werden.
   2. Inkubieren Sie den Deckmantel über Nacht mit 400 μL 10 μg/mL Poly-D-Lysin bei 4 °C. Decken Sie die Platte mit Alufolie ab, um sie vor Licht zu schützen.
   3. Am nächsten Tag nehmen Sie den Teller aus dem Kühlschrank und waschen Sie den Deckdeckel zweimal mit 1 ml Wasser.
   4. Lass den Deckdeckel trocknen.
   5. Verdünne 20 μL (2 x 10⁶) Mtb-R Ags in 180 μL 1x PBS. Die letzten 200 μL reichen aus, um einen Deckmantel vollständig abzudecken.
   6. Inkubieren Sie den Deckmantel mit Mtb-R Ags für 1 Stunde bei 37 °C in einem Zellinkubator.
   7. Entsorgen Sie die restliche Flüssigkeit und waschen Sie zweimal mit 1 ml 1x PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung).
      HINWEIS: In diesem Schritt kann die korrekte Haftung von Mtb-R an den Deckmantel mit einem Fluoreszenzmikroskop mit den Filtern überprüft werden, die dem roten Kanal entsprechen.
   8. Fügen Sie 400 μL Blockierungspuffer (10 % fetales Rinderserum (FBS)) in 1x Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)) für 30 Minuten bei RT in der Bewegung (Shaker) hinzu.
   9. Waschen Sie zweimal mit 400 μL Blockpuffer.
   10. Inkubieren Sie mit 100 μL Proteinextrakt, verdünnt in 300 μL 1x PBS für 2 Stunden bei RT in der Bewegung (Shaker).
   11. Füge 400 μL 1% Formaldehyd hinzu, verdünnt in 1x PBS. Inkubiere 15 Minuten unter Rührung (Shaker) bei RT.
   12. Fügen Sie 500 μL Glycin 0,125 M in Wasser hinzu. Inkubiere 5 Minuten unter Rührung (Shaker) bei RT.
   13. Waschen Sie zweimal mit 1 ml 1x PBS.
   14. Fügen Sie 400 μL 2 mM Ethylenglykol-bis(Succinimidylsuccinat) (EGS für 1 Stunde bei RT im Rühren (Shaker) hinzu.
   15. Schritt 1.1.13 wiederholen
       HINWEIS: Die Herstellung der Reagenzien zum Zeitpunkt der Anwendung wird dringend empfohlen.
2. SLAMF1-Färbung
   1. Wickle den Deckel der Kulturplatte in Paraffinfolie.
   2. Geben Sie einen Tropfen von 60 μL des zuvor titrierten Anti-SLAMF1-Primärantikörpers (1:75 Verdünnung) auf das mit Paraffinfolie bedeckte Deckel.
   3. Entfernen Sie vorsichtig den Deckdeckel von der Platte mit gebogen, feinen Spitzen-OP-Pinzetten und Nadeln.
      HINWEIS: Um das Entfernen der Deckung zu erleichtern, kann die Nadel in einem Winkel von etwa 45° gebogen werden.
   4. Kehren Sie den Deckungsumschlag über den Tropfen, der den Antikörper enthält, um. Inkubiere 30 Minuten im RT im Dunkeln.
   5. Heben Sie den Deckmantel ab und waschen Sie zweimal mit dem Blockpuffer.
   6. Invertieren Sie den Deckfolie über einen neuen Tropfen, der den sekundären Antikörper enthält (1:200-Verdünnung). Inkubiere 30 Minuten im RT im Dunkeln.
   7. Wiederholen Sie Schritt 1.2.5.
   8. Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit und befestigen Sie den Deckdeckel auf einen Tropfen Befestigungsflüssigkeit, der auf einem Glasrutscher platziert ist.
   9. Beobachten Sie unter dem Fluoreszenzmikroskop mit geeigneten Filtern.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, unter sterilen Bedingungen zu arbeiten. Verdünnen Sie die Antikörper im Blockierungspuffer. Führen Sie den Deckdeckel vorsichtig, um Kratzer zu vermeiden, die die Beobachtung unter dem Mikroskop behindern könnten. Eine für Fluoreszenz geeignete Montageflüssigkeit wird dringend empfohlen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Alexa Fluor 488 Sekundärantikörper	Invitrogen	A21121	Für die Fluoreszenzmikroskopie
Anti-SLAMF1 Primärantikörper	BioLegend	306302	Für die Fluoreszenzmikroskopie
Aqua-Poly/Montierung	Polywissenschaften	18606-20	Montagemedien
Deckfolien 12mm	HDA	-	Für den Interaktionstest mittels Mikroskopie
EGS	ThermoFisher Scientific	21565	Zur Vernetzungsbehandlung
Formaldehyd	Merck	K47740803613	Zur Vernetzungsbehandlung
Glasrutschen	Glass Klass	-	Für den Interaktionstest mittels Mikroskopie
Glycin	Sigma	G8898	Zur Vernetzungsbehandlung
Imager.A2	Carl Zeiss	430005-9901-000	Fluoreszenzmikroskop mit Colibri 7 Beleuchtungsmodul
Poly-D-Lysin	Sigma Aldrich	A-003-M	Für die Behandlung von Coverslips
Rhodamin B	Sigma Aldrich	21955	Für M. Tuberkulose-Färbung