Entwicklung eines Zebrafisch-Larveninfektionsmodells unter Verwendung von Mikrogavage

Zusammenfassung

Quelle: Li, J. et al. Entwicklung eines Larven-Zebrafisch-Infektionsmodells für Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020).

Dieses Video demonstriert das Mikrogavage-Verfahren, bei dem eine betäubte Zebrafischlarve in Agarose immobilisiert und oral mit einer Tracer-Nadel mit einem pathogenen Bakterium injiziert wird. Die nicht-invasive Verabreichung ahmt eine natürliche Infektion nach und ermöglicht so die Analyse bakterieller Replikation, Toxinfreisetzung und Darmepithelschäden.

Protokoll

1. Schale der Zebrafischlarven

1. Kalibrieren Sie die Mikrogavage-Nadel.
2. Messen Sie den Durchmesser der Nadelspitze, indem Sie die Nadel mit einem Tropfen Mineralöl auf einen Kalibrierungsträger legen. Stellen Sie sicher, dass die Spitze 30–40 μm im Durchmesser, stumpf und glatt ist. Werfen Sie die scharfen oder rauen Nadeln weg.
   HINWEIS: Scharfe Kanten der Nadeln können durch schnelles Flammen abgestumpft werden.
3. Bereite die Gavage-Lösung vor.
4. Lade und montiere die Nadel auf einen Mikromanipulator.
5. Stellen Sie den Mikromanipulator so ein, dass die Nadel in einem Winkel von 45° positioniert wird.
6. Betäuben Sie die Larven der Zebrafische. Wenn die Larven aufhören sich zu bewegen, werden sie mit einer Pasteur-Pipette in die Rille einer Mikrogavageform übertragen.
7. Geben Sie einen Tropfen mit 0,8 % niedrig schmelzender Agarose auf die Zebrafischlarven, um sie abzudecken. Richten Sie die Larven vorsichtig mit dem Kopf aufrecht in 45° Winkel in der Rinne und den Schwänzen an der Wand der Rinne an. Stellen Sie sicher, dass die Winkel der Köpfe ungefähr gleich sind, damit sie mit dem Winkel der Gavage-Nadeln ausgerichtet sind. Stellen Sie die Mikrogavageform für 30–60 Sekunden auf Eis, damit die niedrigschmelzende Agarose erstarren kann, um die Positionen der Larven zu stabilisieren.
8. Stellen Sie den Einspritzdruck zwischen 200–300 hPa ein. Stellen Sie die Injektionszeit auf 0,1–0,3 s ein, um ein Injektionsvolumen von 3–5 nL Clostridioides difficile zu erhalten.
9. Führen Sie die Nadel vorsichtig durch die Agarose, dann in den Mund der Zebrafischlarven und durch die Speiseröhre. Sobald die Spitze der Nadel im vorderen Darmknollen ist, drücken Sie das Injektionspedal, um die Bakterien freizusetzen. Füllen Sie das Lumen des Darms mit dem gelieferten Volumen. Lassen Sie es nicht aus der Speiseröhre oder Kloake überlaufen. Ziehen Sie die Nadel vorsichtig aus dem Maul des Zebrafischs.
10. Nach dem Gavage werden die infizierten Zebrafischlarven mit einer flexiblen Mikroladespitze aus der Agarose gerettet, indem man die Agarose zuerst abschneidet und dann die Larven anhebt. Übertragen Sie diese Larven in steriles 30 % Danieau-Medium. Die Larven zweimal in sterilem Medium abspülen. Geben Sie die Larven in eine frische 10 cm Petrischale. Die Larven werden bis zu 11 Tage nach der Befruchtung (DPF) erhalten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Agarose	Sigma-Aldrich	A2576	Ultra-niedrig gelierende Agarose
Agarose niedrigschmelzend (LM)	Pronadisa	8050	Er wird in Agaroseplatten verwendet
Kapillarglas	Harvard-Apparat	30-0019	Injektionsnadeln
Clostridioides difficile			R20291, ein Ribotyp-027-Stamm, TcdA+/TcdB+/CDT+ Produktion
DMSO	Carl Roth GmbH	A994
FIJI	Open-Source-Plattform		Bildverarbeitung
HEPES	Carl Roth GmbH	6763
Horizontaler Nadelzieher	Sutter Instrument Inc.	P-87
L-Cystein	Sigma-Aldrich	168149
Leica Application Suite X (LAS X)	Leica		Bildverarbeitung
Mikroinjektor	Eppendorf	5253000017
Mikrospritzgussformen	Adaptive Wissenschaftswerkzeuge	TU1
Leica SP8 Konfokalmikroskop	Leica
Phenolrot	Sigma-Aldrich	P0290
Kaliumchlorid (KCl)	Carl Roth GmbH	5346
Natriumchlorid (NaCl)	Carl Roth GmbH	9265
Taurocholat	Carl Roth GmbH	8149
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
Hefeextrakt	BD Bacto	212750