Inokulation eines bakteriellen Erregers in Arabidopsis-Blätter mittels Vakuuminfiltration

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Rufián, J. S., et.al. Einzelzellanalyse der Expression von Pseudomonas syringae-Genen im Pflanzengewebe. J. Vis. Exp. (2022)

Dieses Video demonstriert eine Vakuuminfiltrationsmethode, um einen bakteriellen Erreger in die Blätter von Arabidopsis-Pflanzen einzuführen. Der Ansatz verwendet eine präparierte bakterielle Suspension und Vakuumimpulse, um einen gleichmäßigen Eintritt durch die Spaltöffnungen zu ermöglichen, was zu einer kontrollierten Blattinfektion führt.

Protokoll

1. Impfung von Arabidopsis-Pflanzen

HINWEIS: In dieser Studie wurden die Stämme Pseudomonas syringae pv . Tomate DC3000 und P. syringae pv. phaseolicola 1448A wurden verwendet.

Bereite das P. syringae-Inokulum vor .
1. Ziehen Sie den interessanten P. syringae-Stamm von einem −80 °C Glycerolfond auf eine LB-Platte (10 g/L Trypton, 5 g/L NaCl, 5 g/L Hefeextrakt und 16 g/L bakteriologischen Agar), ergänzt mit den passenden Antibiotika. Inkubieren Sie bei 28 °C für 40–48 Stunden.
  HINWEIS: Der Einsatz von Antibiotika wird empfohlen, wenn der interessierte Stamm ein Plasmid oder ein genomisches Resistenzgen trägt. Die empfohlenen Antibiotikakonzentrationen für P. syringae sind wie folgt: Kanamycin (15 μg/mL), Gentamycin (10 μg/mL), Ampicillin (300 μg/mL).
2. Entfernen Sie die bakterielle Biomasse und lassen Sie sie in 5 mL 10 mM MgCl₂ neu suspendieren. Messe den OD₆₀₀ und passe auf 0,1 ein, indem du 10 mM MgCl₂ hinzufügst.
  HINWEIS: Ein OD₆₀₀ von 0,1 einer P. syringae-Kultur entspricht 5 x 10⁷CFU·mL⁻¹.
3. Führen Sie serielle Verdünnungen in 10 mM MgCl₂ durch, um eine endgültige Inokulumkonzentration von 5 x 10^mm CFU·mL⁻¹ zu erreichen. Bereiten Sie 200 ml Inokulum für die Arabidopsis-Pflanzen vor.
4. Direkt vor der Impfung wird das Tensid Silwett L-77 zu einer Endkonzentration von 0,01 % für Arabidopsis hinzugefügt. Beachten Sie, dass Silwett dem Arabidopsis-Gewebe etwas nachteilig ist.
Führen Sie eine Vakuuminfiltration durch.
1. Für die Arabidopsis-Infiltration setzen Sie zwei Holzstäbchen, die ein X bilden, über den Topf (Abbildung 1E) und legen Sie den Topf mit dem Rücken nach unten auf eine 14 cm große Petrischaal, die das 200-ml-Inokulum enthält (Abbildung 1F).
2. Führe die Pflanzen, die in der Inokulumlösung eingetaucht sind, in eine Vakuumkammer ein (Abbildung 1G) und gib einen Impuls von 500 mbar für 30 Sekunden, um die Blätter zu infiltrieren. Wiederholen Sie den Vakuumimpuls 2-3 Mal, bis das Blatt vollständig durchdrungen ist (Abbildung 1H).
3. Lassen Sie die überschüssige Inokulumlösung mit einem Blatt Papier ablaufen und bringen Sie die Pflanzen zurück in ihre entsprechende Wachstumskammer.

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Ergebnisse

Abbildung 1: Bakterielle Impfung und Apoplast-Extraktion mit Arabidopsis-Pflanzen . (A) Vorbereitung des Topfes mit dem richtig befestigten Metallgitter. (B) Aussäen von Samen mit einem Zahnstocher,...