Hochdurchsatzbildgebung der intrazellulären Brucella-Abortus-Infektion in den Epithelzellen des Wirts

Zusammenfassung

Quelle: Casanova, A., et al. Mikroskopiebasierte Assays für Hochdurchsatz-Screening von Wirtsfaktoren, die an der Brucella-Infektion von Hela-Zellen beteiligt sind. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video demonstriert Hochdurchsatzbildgebung einer Brucella-Abortus-Infektion in Epithelzellen mit siRNA-vermittelter STING-Knockdown, um die Rolle der zytosolischen DNA-Erkennung bei der intrazellulären bakteriellen Replikation und der angeborenen Immunantwort des Wirts zu untersuchen.

Protokoll

1. Infektion und Fixierung

1. Einen Tag vor der Infektion sollte die bestimmte Menge der B. abortus-Starterkultur in 50 ml TSB/Km (tryptische Sojabrühe mit 50 μg/ml Kanamycin) Medium in einer 250 ml Schraubdeckelflasche inokuliert werden. Versiegeln Sie die Flasche mit Parafilm und lassen Sie über Nacht Bakterien bei 37 °C und 100 U/min auf einem Orbitalshaker auf OD₆₀₀ = 0,8-1,1 wachsen.
2. Messen Sie OD₆₀₀ der Bakterienkultur und bereiten Sie das Infektionsmedium vor, indem Sie die Bakterienkultur in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) /10 % FCS (Fetal Calf Serum) verdünnen, um die gewünschte Infektionsmultiplikation (MOI) z....

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Tryptische Sojabrühe (TSB)	Fluka	22092
Kanamycin-Sulfat	Sigma-Aldrich	60615
250 ml Schraubdeckelflasche	Corning	8396
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
Fetales Kalbserum (FCS)	Gibco	10270	Hitzeinaktiviert
Greiner CELLSTAR 384-Well-Platte	Sigma-Aldrich	M2062
Abziehbare Alufolie	Co-Star	6570
Reagenzspender: "Multidrop 384 Reagenzspender"	Thermowissenschaftlich	5840150	Ein alternativer Reagenzspender kann verwendet werden.
Transfektionsreagenz: "Lipofectamin RNAiMAX	Invitrogen	13778-150
Automatisierte Plattenscheibenmaschine: "Plattenscheiben ELx50-16"	BioTek	ELX5016	Dieser Plattenverteiler enthält einen 16-Kanal-Verteiler, der für 384 Bohrlochplatten geeignet ist. Er passt in einen Biosicherheitsschrank und hat einen Deckel, der die Platte beim Waschen bedeckt, was das Risiko der Aerosolbildung verringert. Alternative Plattenscheiben mit ähnlichen Eigenschaften konnten verwendet werden.
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G1397
PBS	Gibco	20012
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6148	Lösen Sie sich im 0,2 M HEPES-Puffer, pH 7,4. Lagere bei -20 °C und taue frisch am Tag vor der Verwendung auf. Vorsicht: PFA ist toxisch beim Einatmen, bei Hautkontakt und beim Schlucken.
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
DAPI	Roche	10236276001
Kif11 siRNA	Dharmacon	L-003317-00
ARPC3 siRNA	Dharmacon	L-005284-00
Brucella abortus 2308
HeLa CCL-2	ATCC	CCL-2
ImageXpress Micro	Molekulare Bauelemente	IXM IMAGING MSCOPE	Automatisiertes zelluläres Bildmikroskop, ausgestattet mit einer präzisionsmotorisierten Z-Stufe. Alternative Systeme für automatisierte Mikroskopie sowie alternative Komponenten für Hard- und Software, wie unten spezifiziert, können eingesetzt werden.