Hochdurchsatzbildgebung der intrazellulären Brucella-Abortus-Infektion in den Epithelzellen des Wirts

Zusammenfassung

Quelle: Casanova, A., et al. Mikroskopiebasierte Assays für Hochdurchsatz-Screening von Wirtsfaktoren, die an der Brucella-Infektion von Hela-Zellen beteiligt sind. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video demonstriert Hochdurchsatzbildgebung einer Brucella-Abortus-Infektion in Epithelzellen mit siRNA-vermittelter STING-Knockdown, um die Rolle der zytosolischen DNA-Erkennung bei der intrazellulären bakteriellen Replikation und der angeborenen Immunantwort des Wirts zu untersuchen.

Protokoll

1. Infektion und Fixierung

1. Einen Tag vor der Infektion sollte die bestimmte Menge der B. abortus-Starterkultur in 50 ml TSB/Km (tryptische Sojabrühe mit 50 μg/ml Kanamycin) Medium in einer 250 ml Schraubdeckelflasche inokuliert werden. Versiegeln Sie die Flasche mit Parafilm und lassen Sie über Nacht Bakterien bei 37 °C und 100 U/min auf einem Orbitalshaker auf OD₆₀₀ = 0,8-1,1 wachsen.
2. Messen Sie OD₆₀₀ der Bakterienkultur und bereiten Sie das Infektionsmedium vor, indem Sie die Bakterienkultur in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) /10 % FCS (Fetal Calf Serum) verdünnen, um die gewünschte Infektionsmultiplikation (MOI) zu erreichen.
   HINWEIS: Um eine Infektionsrate von 5–10 % in HeLa-Zellen zu erreichen, wird ein MOI von 10.000 verwendet. Für jeden Zelltyp sollte eine MOI-Titrationskurve durchgeführt werden, um optimale Infektionsraten zu erreichen.
3. Tauschen Sie das Transfektionsmedium der 384-Well-Platte mit 50 μl des Infektionsmediums mithilfe eines automatischen Plattenreinigers aus.
4. Zentrifugieren Sie die 384-Well-Platte bei 400 x g und 4 °C für 20 Minuten.
   HINWEIS: Das hilft, den Infektionsprozess zu synchronisieren.
5. Versiegeln Sie die Platte mit Parafilm und bebrüten Sie sie auf einer vorgewärmten Aluminiumplatte in einem 37 °C feuchten Inkubator mit 5 %_{CO2 für 4} Stunden.
6. Waschen Sie die Zellen mit DMEM/10 % FCS mit 100 μg/ml Gm (Gentamicin), um extrazelluläre Bakterien mit dem automatischen Plattenreiniger zu inaktivieren (200 μl/Well-Überlaufspülung).
   HINWEIS: Während einer Überlaufwäsche dosiert und aspiriert der automatische Plattenreiniger gleichzeitig das Medium.
7. Für den Eintrittstest werden die Zellen ein zweites Mal mit DMEM/10 % FCS mit 100 μg/ml Gm und 100 ng/ml aTc mit dem automatischen Plattenreiniger gewaschen (200 μl/Well Overflow Wash verwendet).
8. Versiegeln Sie die Platte mit Parafilm und legen Sie sie für weitere 40 oder 4 Stunden auf eine vorgewärmte Aluminiumplatte im 37 °C feuchten Inkubator mit 5 % CO2 zurück, für den Endpunktstest bzw. den Eintrittstest.
9. Zur Fixierung werden die Bohrlöcher mit PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) mit dem automatischen Plattenreiniger gewaschen (200 μl/Well-Überlaufspülung).
10. Tauschen Sie PBS mit 50 μl 3,7 % Paraformaldehyd (PFA) in 0,2 M HEPES bei pH 7,4 mithilfe des automatischen Plattenreinigers aus.
    HINWEIS: Vorsicht: PFA ist toxisch beim Einatmen, bei Hautkontakt und beim Schlucken.
11. Inkubieren Sie 20 Minuten bei Zimmertemperatur.
12. Tauschen Sie das Fixationsmedium mit 50 μl PBS mithilfe der automatischen Plattenscheibenmaschine aus.
    HINWEIS: Die Proben können jetzt bei Bedarf aus dem BSL3 entnommen werden.
    VORSICHT: Die Entnahme einer Probe aus einer BSL3-Einrichtung (Biosicherheitsstufe 3) unterliegt der Risikobewertung und Validierung des Verfahrens und hängt von den geltenden Vorschriften zur Biosicherheit ab.

2. Verfärbung

1. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 50 μl PBS.
2. Permeabilisieren von Zellen in 50 μl 0,1 % Triton-X-100 in PBS für 10 Minuten.
3. Wasche die Zellen dreimal mit PBS. Fügen Sie 20 μl PBS mit 1 μg/ml DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindol) hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur.
4. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS und schützen Sie die Flecken vor Licht mit Alufolie.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Tryptische Sojabrühe (TSB)	Fluka	22092
Kanamycin-Sulfat	Sigma-Aldrich	60615
250 ml Schraubdeckelflasche	Corning	8396
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
Fetales Kalbserum (FCS)	Gibco	10270	Hitzeinaktiviert
Greiner CELLSTAR 384-Well-Platte	Sigma-Aldrich	M2062
Abziehbare Alufolie	Co-Star	6570
Reagenzspender: "Multidrop 384 Reagenzspender"	Thermowissenschaftlich	5840150	Ein alternativer Reagenzspender kann verwendet werden.
Transfektionsreagenz: "Lipofectamin RNAiMAX	Invitrogen	13778-150
Automatisierte Plattenscheibenmaschine: "Plattenscheiben ELx50-16"	BioTek	ELX5016	Dieser Plattenverteiler enthält einen 16-Kanal-Verteiler, der für 384 Bohrlochplatten geeignet ist. Er passt in einen Biosicherheitsschrank und hat einen Deckel, der die Platte beim Waschen bedeckt, was das Risiko der Aerosolbildung verringert. Alternative Plattenscheiben mit ähnlichen Eigenschaften konnten verwendet werden.
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G1397
PBS	Gibco	20012
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6148	Lösen Sie sich im 0,2 M HEPES-Puffer, pH 7,4. Lagere bei -20 °C und taue frisch am Tag vor der Verwendung auf. Vorsicht: PFA ist toxisch beim Einatmen, bei Hautkontakt und beim Schlucken.
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
DAPI	Roche	10236276001
Kif11 siRNA	Dharmacon	L-003317-00
ARPC3 siRNA	Dharmacon	L-005284-00
Brucella abortus 2308
HeLa CCL-2	ATCC	CCL-2
ImageXpress Micro	Molekulare Bauelemente	IXM IMAGING MSCOPE	Automatisiertes zelluläres Bildmikroskop, ausgestattet mit einer präzisionsmotorisierten Z-Stufe. Alternative Systeme für automatisierte Mikroskopie sowie alternative Komponenten für Hard- und Software, wie unten spezifiziert, können eingesetzt werden.