Photobleaching cyanobakterieller Pigmente zur Bildgebung wachstumsregulierender Proteine

Zusammenfassung

Quelle: Zhan, Y., et al. Photobleaching ermöglicht eine Superauflösungsbildgebung des FtsZ-Rings im Cyanobacterium prochlorococcus. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video demonstriert das Verfahren zur Photobleachung von Pigmenten in cyanobakteriellen Zellen unter Verwendung von Xenonlicht unter kalten Bedingungen, um die Fluoreszenzbildgebung wachstumsregulierender Proteine zu verbessern.

Protokoll

1. Photobleaching der Chlorophyllpigmente in einem Blockierungsschritt

1. Übertragen Sie den Deckzettel auf die Beizschale. Fügen Sie 50 μL Blockpuffer hinzu, der 0,2 % (v/v) nicht-ionisches Waschmittel-100 und 3 % (v/v) Ziegenserum enthält, auf den Deckzettel.
2. Legen Sie die gesamte Färbplatte auf Eis und legen Sie sie mindestens 60 Minuten unter die Xenon-Lichtquelle zur Photobleaching, mit einer Lichtintensität von 1.800 μmol Photonen/m²·s.
3. Nach dem Photobleaching und Blockieren entfernen Sie den Blockpuffer vorsichtig, indem Sie ihn mit dem Rand eines Küchenpapiers aufnehmen.
   HINWEIS: Die Intensität des Xenonlichts ist so hoch, dass eine passende Sonnenbrille zum Augenschutz erforderlich ist. Wickle währenddessen die Lichtquelle und die Platte mit Alufolie um, um Lichtlecks zu vermeiden, das Augenschäden verursachen kann. Überprüfen Sie den Deckzettel alle 15 Minuten, um sicherzustellen, dass er feucht bleibt. Wenn es trocken ist, gib 50 μL Blockpuffer hinzu.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Polystyrolpartikel	Spherotech	S. 20-10	2,0–2,4 μm
Coverslip	Marienfeld	111580	18 mm ∅, Dicke Nr. 1
Ethanol	Scharlau	ET00021000
Poly-L-Lysinhydrobromid	Sigma-Aldrich	P9155	MOL WT 70.000–150.000
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	158127
Glutaraldehydlösung, 50 %	Sigma-Aldrich	340855
PBS	Sigma	P3813
Triton X-100	Sigma	T8787
EDTA-Dinatriumsalz, 2-Hydrat	Goldbiotechnologie	E-210-500
Trizma-Basis	Sigma	T1503
Lysozym	Sigma	L6876
Ziegenserum	Sigma	G9023
XD-300 Xenon-Lichtquelle			250 W