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1. D2O-Einbaubehandlung in Gegenwart von Antibiotika (Abbildung 1a)
- Überprüfen Sie die bakterielle Konzentration, indem Sie die optische Dichte (OD) mit einem Photometer bei einer Wellenlänge von 600 nm messen.
- Verdünnen Sie die bakterielle Lösung mit dem normalen Mueller-Hinton-Brühemedium (MHB), das kein Deuterium enthält, um eine Endzellkonzentration von 8 x 105 CFU/ml zu erreichen. Vortex, um die Bakterienzellen zu mischen.
- Bereiten Sie 300 μL Aliquot der bakteriellen Lösung in sieben 1,5 mL Mikroröhren und 600 μL Aliquot der bakteriellen Lösung in einem 1,5 mL Mikroröhrchen vor.
- Fügen Sie 4,8 μL Antibiotikum-Lagerlösung (1 mg/mL) in das Mikroröhrchen mit 600 μL der bakteriellen Lösung hinzu, um die endgültige Antibiotikumkonzentration auf 8 μg/mL zu erreichen.
- Entnehmen Sie 300 μL Lösung aus den 8 μg/mL der antibiotikahaltigen Bakterienlösung und fügen Sie weitere 300 μL bakterielle Lösung hinzu, um eine zweifach verdünnte antibiotika- (4 μg/mL) bakterienhaltige Lösung herzustellen.
- Wiederholen Sie die zweifache serielle Verdünnung der Testantibiotika Gentamicin oder Amoxicillin, bis das Mikrorohr mit der niedrigsten Konzentration (0,25 μg/mL) erreicht ist, und entsorgen Sie 300 μL aus dem Rohr. Sowohl für Gentamicin als auch Amoxicillin liegen die Serienkonzentrationen zwischen 0,25 μg/mL und 8 μg/mL.
- Lass ein Schlauch ohne Antibiotika für die Kontrolle der Leerheit liegen. Dies ist die positive Kontrolle zur Inspektion der bakteriellen Stoffwechselaktivität ohne Antibiotikabehandlung, aber mitD2O-Behandlung.
- Lass eine Sonde ohne Antibiotika undohne D2Ofür die Negativkontrolle stehen.
- Inkubieren Sie das bakterielle Aliquot mit einem bestimmten Antibiotikum (Gentamicin oder Amoxicillin), das MHB-Medium enthält, 1 Stunde lang.
- Während der Inkubation wird eine serielle Verdünnung von Antibiotika mit einem 100 %D2O-haltigenMedium mit demselben Konzentrationsgradienten wie in Schritt 1.6 hergestellt vorbereitet. Sowohl für Gentamicin als auch Amoxicillin liegen die Serienkonzentrationen zwischen 0,25 μg/mL und 8 μg/mL.
- Nach 1 Stunde Antibiotikabehandlung fügen Sie 700 μL seriell verdünntes Antibiotikum und 100 % D2O-haltiges MHB-Medium zu den 300 μL antibiotika-vorbehandelten Bakterien in derselben Antibiotikakonzentration (hergestellt in Schritt 1.6) hinzu.
- Zum Beispiel fügen Sie 700 μL des 100% D2O-haltigen MHB-Mediums (mit 8 μg/mL Antibiotikum) zu den 300 μL von 8 μg/mL antibiotika vorbehandelten Bakterien hinzu. Auf die gleiche Weise wird auf die entsprechenden Röhren der nächsten Konzentration übertragen und durch mehrfaches Pipettern auf und ab homogenisiert.
- Fügen Sie 700 μL antibiotikafreies, 100%D2O-haltiges MHB-Medium zu 300 μL antibiotikafreien Bakterien (vorbereitet in Schritt 1.6.1) als Blankkontrolle hinzu.
- Inkubieren Sie bei 37 °C in einem Inkubationsschüttler bei 200 U/min für weitere 30 Minuten.
HINWEIS: In diesem Schritt beträgt die Endkonzentration von D2O im Medium für den Test 70 %.
- Zentrifugieren Sie zuerst die 1 mL Antibiotika-undD2-O-behandelte Bakterienprobe bei 6200 x g für 5 Minuten bei 4 °C und waschen Sie anschließend zweimal mit gereinigtem Wasser. Abschließend werden die Proben in einer 10%igen Formalinlösung fixiert und bei 4 °C gelagert.
2. stimulierte Raman-Scattering (SRS)-Bildgebungder D2O-Stoffwechselintegration in einem einzelnen Bakterium
- Waschen Sie 1 ml feste Bakterienlösung mit gereinigtem Wasser und zentrifugieren Sie dann bei 6200 x g für 5 Minuten bei 4 °C. Entfernen Sie das Überwasserstoff. Anreichern Sie die bakterielle Lösung auf etwa 20 μL.
- Die bakterielle Lösung auf ein mit Poly-L-Lysin beschichtetes Deckglas abgeben. Sandwiche und versiegele die Probe für SRS-Bildgebung.
- Bilde Bakterien bei der C-D-Schwingungsfrequenz bei 2168 cm-1 mit einem SRS-Mikroskop.
- Geben Sie die Pumpenwellenlänge mit der Steuersoftware auf einem Computer ein und stellen Sie die Wellenlänge der Pumpe auf 852 nm ein.
- Messen Sie die Laserleistung mit einem Leistungsmessgerät. Stellen Sie die Leistung des Pumpenlasers an der Probe auf ~8 mW und die Leistung des Stokes-Lasers an der Probe auf ~40 mW ein, indem Sie die Halbwellenplatte vor dem Laserausgang einstellen.
HINWEIS: Im SRS-Mikroskop liefert ein abstellbarer Femtosekundenlaser mit einer Wiederholrate von 80 MHz die Pump- (680 bis 1300 nm) und Stokes-(1045 nm) Anregungslaser.
- Durch das Einstellen der Schrauben der Spiegelreflexionen wird die Pumpe und die Stokes-Strahlen räumlich ausgerichtet und die beiden Strahlen in ein aufrechtes Mikroskop mit einem 2D-Galvo-Spiegelsystem für Laserscans geleitet.
- Verwenden Sie ein 60-faches Wasserimmersionsobjektiv, um die Pumpe und die Stokes-Laser auf die Probe zu fokussieren.
- Verwenden Sie einen Ölkondensator, um die Signale der Probe in Vorwärtsrichtung zu sammeln.
- Verwenden Sie einen Bandpassfilter, um den Stokes-Laser herauszufiltern, bevor Sie ihn in eine Photodiode leiten.
- Das stimulierte Raman-Signal mit einem Lock-in-Verstärker extrahieren und die Signale mit einer Photodiode detektieren.
- Stellen Sie jedes SRS-Bild im Systemfeld der Software auf 200 x 200 Pixel und die Pixel-Verbleihzeit auf 30 μs ein. Die gesamte Aufnahmezeit für ein Bild beträgt ~1,2 Sekunden. Stellen Sie die Schrittlänge auf 150 nm ein, sodass die Bildgröße etwa 30 x 30 μm2 beträgt. Stellen Sie sich für jede Probe mindestens drei Sichtfelder vor.