Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Atmung von Mitochondrien aus Skelettmuskulatur isoliert zu studieren. Diese Methode wurde von Scorrano angepasst Et al. (2007). Die Mitochondrien isoliert Verfahren erfordert etwa 2 Stunden. Die mitochondriale Atmung kann in ca. 1 Stunde abgeschlossen sein.
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Methodenartikel
Mitochondriale Isolation von der Skelettmuskulatur
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Mitochondrien sind Organellen Steuerung der Leben und Tod der Zelle. Sie in wichtigen Stoffwechselreaktionen beteiligt, synthetisieren die meisten der ATP, und regeln eine Reihe von Signalkaskaden 2,3. Vergangene und gegenwärtige Forscher haben isolierte Mitochondrien aus Ratten und Mäusen Gewebe wie Leber, Gehirn und Herz 4,5. In den letzten Jahren haben viele Forscher auf die Untersuchung der mitochondrialen Funktion von Skelettmuskeln konzentriert.
Hier beschreiben wir eine Methode, die wir erfolgreich für die Isolierung von Mitochondrien aus Skelettmuskeln 6 verwendet. Unser Verfahren erfordert, dass alle Puffer und Reagenzien hergestellt sind frisch und müssen etwa 250-500 mg der Skelettmuskulatur. Wir untersuchten Mitochondrien aus Ratte und Maus gastrocnemius und Zwerchfell isoliert und Ratte Augenmuskeln. Mitochondriale Protein-Konzentration wird mit dem Bradford-Assay gemessen. Es ist wichtig, dass die mitochondriale Proben aufbewahrt eiskalt während der Vorbereitung und funktionelle Studien in relativ kurzer Zeit (~ 1 h) durchgeführt werden kann. Mitochondriale Atmung gemessen mittels Polarographie mit einer Clark-Elektrode (Oxygraph System) bei 37 ° C 7. Die Kalibrierung der Sauerstoffelektrode ist ein wichtiger Schritt in diesem Protokoll und muss täglich durchgeführt werden. Isolierte Mitochondrien (150 ug) sind bis 0,5 ml der experimentellen Puffer (EB) aufgenommen. State 2 Atmung beginnt mit Zusatz von Glutamat (5mm) und Malat (2,5 mM). Dann wird Adenosindiphosphat (ADP) (150 nM) zugegeben, um den Zustand 3 zu beginnen. Oligomycin (1 pM), einer ATPase-Synthase-Blocker, wird verwendet, um den Zustand 4 zu schätzen. Schließlich Carbonyl Cyanid p-[Trifluormethoxy]-phenyl-Hydrazon (FCCP, 0,2 uM) wird zugegeben und 5 measurestate oder abgekoppelt Atmung 6. Die Atmung kontrollieren Verhältnis (EKV), das Verhältnis von Staat 3 bis Zustand 4 wird nach jedem Experiment berechnet. Ein RCR ≥ 4 wird als Beweis für eine tragfähige Mitochondrien Vorbereitung berücksichtigt.
Zusammenfassend stellen wir eine Methode zur Isolierung von lebensfähigen Mitochondrien aus Skelettmuskeln, die in biochemischen (zB Enzymaktivität, Immundetektion, Proteomik) und funktionelle Untersuchungen (mitochondriale Atmung) genutzt werden können.
Protokoll
1. Herstellung der Puffer
- Schalten Sie Zentrifuge 5804R und auf 4 ° C. Schalten Sie Isotemp 3006D Wasserbad und auf 37 ° C.
- Stellen Sie folgende Lösungen vor Muskel-Isolation:
- PBS: Lösen Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS)-Tabletten in destilliertem Wasser (5 Tabletten / Liter). Gut mischen.
- PBS plus 10 mM EDTA: So bereiten Sie eine 100 ml-Lösung, 2 ml 500 mM EDTA und 98 ml PBS.
- 8X Mitochondrien Puffer: 10,28 g Saccharose für eine Endkonzentration von 0,6 M, 400 mg der freien Fettsäuren Rinderserumalbumin (BSA) für eine Endkonzentration von 0,8%, 2,08 g HEPES für eine Endkonzentration von 160 mM, pH auf 7,4 und ....
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Diskussion
Wir präsentieren ein Protokoll, um lebensfähige Mitochondrien aus Skelettmuskulatur zu isolieren. Wenn Ertrag ist ein Problem, kann das Protokoll durch Inkubation der isolierten Muskel in 5 ml PBS/10mM EDTA/0.01% Trypsin für 30 Minuten in Eis verändert werden. Um sicherzustellen, komplette Muskel-Verdau mit Trypsin, muss der Muskel vollständig zerkleinert werden. Nach dem 30-minütigen Inkubation, muss der PBS/10mM EDTA/0.01% Trypsin-Lösung komplett mit 3 ml der Isolation Puffer 1 (IB1) ersetzt werden. Darüber hinaus kan.......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Eye Institute (R01 EY12998) an der FH Andrade unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 95% CO2 / 5% O2-Gemisch | Lokaler Gaslieferant | ||
| Natriumsalz von Adenosin-5′-diphosphat | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Blaues Rizla-Papier | Hansatech | 890101 | |
| Bradford-Protein-Assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Carbonylcyanid-p-trifluormethoxyphenylhydrazon (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Zentrifuge 5804R | Eppendorf | ||
| Komprimierter Stickstoff | Lokaler Gaslieferant | ||
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M9647 | |
| Ethylenglycol-bis-tetraessigsäure (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethylenediamintetraessigsäure (EDTA) | Bio-Rad | 161-0728 | |
| Freie Fettsäuren an Rinderserumalbumin gebunden | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| Glutaminsäure | Sigma-Aldrich | G5889 | |
| Natriumsalz von HEPES | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| Isotemp 3006D | Fisher Scientific | ||
| Magnesiumchlorid | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Männliche Sprague-Dawley-Ratten | Harlan Laboratories | 300–500 g | |
| Apfelsäure | Sigma-Aldrich | M9138 | |
| Minifuge | ISC Bioexpress | C1301P | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Sauerstoffelektroden-Scheibe | Hansatech | S1 | |
| Oxygraph | Hansatech | ||
| Oxygraph Plus V1.01-Software | Hansatech | ||
| pH-Meter | Mettler Toledo | 1225506149 | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Kaliumchlorid | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Kaliumphosphat | Sigma-Aldrich | P8416 | |
| Potter-Elvehjem-Homogenisatoren | Fisher Scientific | 08-414-14A | |
| PTFE-Membran (0,0125 mm × 25 mm) | Hansatech | S4 | |
| Bohrmaschine SKIL 3320 | Baumarkt | ||
| Saccharose | Sigma-Aldrich | S5016 |
Referenzen
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2, 287-295 (2007).
- Duchen, M. R. Roles of mitochondria in health and disease. Diabetes. 53, Suppl 1. S96-S....
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Nachdrucke und Genehmigungen
