Hochauflösende konfokale Bildgebung von pathogen-infizierten Drosophila-Hämozyten

Zusammenfassung

Quelle: Hiroyasu, A., et al. Extraktion von Hämozyten aus Drosophila melanogaster-Larven zur mikrobiellen Infektion und Analyse. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video demonstriert hochauflösende konfokale Bildgebung von Drosophila melanogaster-Hämozyten , die mit Coxiella burnetii infiziert sind, um die Lokalisierung von Erregern in 3D zu visualisieren und so eine detaillierte Analyse intrazellulärer Infektionsdynamiken und Wirts-Erreger-Interaktionen zu ermöglichen.

Protokoll

1. Konfokale Bildgebung
   1. Konfigurieren Sie das konfokale Mikroskop für die Dreifarbbildgebung von DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindol), EGFP (enhanced green fluorescent protein) und mCherry. Verwenden Sie folgende Einstellung: DAPI-Anregung (z.B.) 405 nm, Emission (em) 415-480 nm; EGFP ex 488 nm, em 493-564 nm; mCherry ex 587 nm, em 597-700 nm.
   2. Setzen Sie die Probe auf das Mikroskop und fokussieren Sie die Probe mit einem 63X/1,4 numerischen Aperturobjektiv (NA). Lokalisieren Sie die gewünschten Hämozyten im Sichtfeld für die Bildgebung.
   3. Stellen Sie die Laserleistung und die Detektorverstärkung an, um eine angemessene Belichtung der Probe zu erreichen. Überprüfen Sie mehrere Z-Ebenen, um sicherzustellen, dass der Belichtungspegel für die gesamte Probendicke angemessen ist.
   4. Finde die oberen und unteren Positionen auf der z-Achse eines ganzen Hämozyten. Setze diese Positionen als Start- und Endpositionen für die Z-Sektionierung.
   5. Verwenden Sie nur Scanning-Zoom, um den Bereich mit dem Hämozyten zu fotografieren. Oft werden Zoom-Faktoren von 3X verwendet.
   6. Sammeln Sie die Bildreihen in geeigneter Auflösung wie 1024 x 1024 Pixel in der x-y-Ebene und 0,3 μm Abstand in der z-Dimension.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Coxiella burnetii - mCherry	Dr. Heinzen, R.
Mikroskop-Abdeckungsglas	Fisher Scientific	12-545-80
4', 6-Diamidino-2-Phenylindol	Thermo Fisher Scientific	62247
Konfokale Mikroskopie	Leica	TCS SP8-X Weißlicht-Konfokal-Laser-Rastermikroskop
Objektträger mit dem Mikroskop	Fisher Scientific	12-552-3