Einzelzellanalyse der Genexpression aus pflanzenextrahierenden Krankheitserregern

Zusammenfassung

Quelle: Rufián, J. S. et al. Einzelzellanalyse der Expression von Pseudomonas syringae-Genen im Pflanzengewebe. J. Vis. Exp. (2022).

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Analyse der Genexpression in pflanzenextrahierten, pathogenen Bakterien auf Einzelzellniveau mit einem fluoreszierend markierten Transkriptionsfaktor. Konfokale Bildgebung zeigt Heterogenität in der Expression von Virulenzgenen und hebt die funktionelle Vielfalt innerhalb einer klonalen bakteriellen Population hervor.

Protokoll

1. Einzelzellanalyse der apoplast-extrahierten Bakterien

1. Bereiten Sie eine 1,5%ige Agaroselösung in destilliertem Wasser vor. Nach dem Schmelzen fügen Sie genug Volumen hinzu, um den Raum zwischen zwei nebeneinander angeordneten Objektträgern zu füllen, und legen Sie einen weiteren Objektträger darauf (Abbildung 1). Lass sie 15 Minuten trocknen und entferne vorsichtig den Folien, der oben platziert ist. Mit einer Klinge schneiden Sie das Agarose-Pad direkt vor der Anwendung in 5 mm x 5 mm Stücke.
2. Parallel zentrifugiert man 1 ml der vom Apoplast extrahierten Bakterien bei 12.000 x g für 1 Minute bei Raumtemperatur, entfernt vorsichtig das Supernatant mit einer Pipette und suspendiert das Pellet in 20 μL Wasser, um die Zellen zu konzentrieren. Geben Sie einen 2 μL Tropfen der konzentrierten Zellen auf einen 0,17 mm Deckdeckel und bedecken Sie den Tropfen mit einem 5 mm x 5 mm großen Stück des zuvor in Schritt 1 erhaltenen Agarose-Pads, wie in Abbildung 1 dargestellt.
3. Visualisieren Sie die bakterielle Präparation unter dem konfokalen Mikroskop (siehe Materialtabelle). Zur Identifizierung von grün-fluoreszierenden Bakterien verwenden Sie den Anregungslaser bei 488 nm und einen Emissionsfilter zwischen 500 nm und 550 nm. Um alle Bakterien zu identifizieren, verwenden Sie das helle Feld und führen Sie beide Felder zusammen.
4. Verarbeiten Sie die konfokalen Bilder mit Fiji (siehe Materialtabelle). Dazu verwenden Sie das MicrobeJ-Plugin, um die Kontur der bakteriellen Zelle zu identifizieren und die Fluoreszenzintensität darin zu messen.
   HINWEIS: Für diese Analyse wird eine Bildaufnahme von isolierten Bakterien (nicht gruppiert) empfohlen.

Ergebnisse

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Einstellung und Vorbereitung des Agar-Pads.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,17 mm Abdeckung			Keine besonderen Anforderungen
1,6 x 1,6 mm Metallgitter	Buzifu		Glasfasergitter
50-mL konische Röhren	Sarstedt
Agarose	Merk
Konfokalmikroskop Stellaris	Leica Microsystems
Fidschi-Software