In-vitro-Darmmodell zur Bewertung bakterieller Adhäsion und Internalisierung

Zusammenfassung

Quelle: Calatayud Arroyo, M., et al. Bewertung der Lebensfähigkeit eines synthetischen bakteriellen Konsortiums an der in-vitro-Darm-Wirt-Mikroben-Schnittstelle. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video demonstriert ein in-vitro-Darm-Host-Mikroben-Modell zur Untersuchung der bakteriellen Lebensfähigkeit. Eine Kokultur von Caco-2- und HT29-MTX-Zellen wird mit Bakterien inkubiert, die unter simulierten Verdauungsbedingungen vorbehandelt wurden. Die Integrität der Epithelbarriere wird mit transepithelialem elektrischem Widerstand bewertet, und Fraktionen aus dem Medium, löslichem Schleim, Zelllysat und Zellresten werden für die nachgelagerte Analyse gesammelt.

Protokoll

1. Stämme und Kulturbedingungen

HINWEIS: Die synthetische orale Gemeinschaft bestand aus Stämmen, die häufig im oralen Mikrobiom vorkommen.

1. Folgende Stämme aus der American Type Culture Collection (ATCC) erhalten: Aggregatibacter actinomycetemcomitans (ATCC 43718), Fusobacterium nucleatum (ATCC 10953), Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277), Prevotella intermedia (ATCC 25611), Streptococcus mutans (ATCC 25175), Streptococcus sobrinus (ATCC 33478), Actinomyces naeslundii (ATCC 51655), Streptococcus gordonii (ATCC 49818), Actinomyces viscosus (ATCC 15987) und Streptococcus mitis (ATCC 49456).
2. Erwerb von Veillonella parvula aus dem Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM 2007), Streptococcus sanguinis aus der BCCM/LMG-Bakteriensammlung (LMG 14657) und Verwendung des Streptococcus salivarius-Stamms TOVE-R sowie Streptococcus oralis.

2. Entwicklung einer multispeziesischen Gemeinschaft, die das orale Mikrobiom repräsentiert

HINWEIS: Erzeugen Sie eine synthetische Gemeinschaft, um die potenzielle Adhäsionskapazität oraler Bakterien am in-vitro-Darmepithel zu simulieren. Bakterien werden auf Blutagarplatten gezüchtet, ergänzt mit 5 μg/mL Hemin, 1 μg/mL Menadion und 5 % sterilem defibriniertem Pferdeblut. Kurz gesagt:

1. 100 mg Hemin in 2 ml 1 M Natriumhydroxid (NaOH) auflösen und 100 ml destilliertes, autoklaviertes Wasser hinzufügen. Bewahre sie in einem dunklen Behälter auf. Sterilisieren Sie durch einen 0,22-μm-Filter, bevor Sie das Medium hinzufügen.
2. 100 mg Menadion in 20 mL 96% Ethanol auflösen. Sterilisieren Sie durch einen 0,22-μm-Filter, bevor Sie das Medium hinzufügen.
3. Bereiten Sie 1 Liter Blutagar-Medium (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers und dem Autoklaven vor. Lassen Sie es abkühlen, bevor Sie Pferdeblut und die Nahrungsergänzungsmittel hinzufügen. Rühren und gießen Sie die Teller ein.
4. Bereiten Sie modifizierte Brain Heart Infusion (BHI)-Brühe vor. Fügen Sie nach dem Autoklavieren 5 μg/mL Hemin und 1 μg/mL Menadion hinzu.
5. Gib 9 mL des Mediums in Hungate-Röhren ab und schließe mit einem Gummistopper und einer Aluminiumkappe. Spülen Sie die Schläuche mit Stickstoff/Kohlendioxid oder N₂/CO₂ (90 %/10 %).
6. Entnehmen Sie 1 ml anaerobes Medium mit einer Spritze und legen Sie es in ein 1,5-mL Mikrozentrifugenrohr. Nehmen Sie einzelne Kolonien jeder Bakterienart, lassen Sie sie im Medium wieder suspendieren und dann zurück in das anaerobe modifizierte BHI überführen. Inkubieren Sie 48 Stunden bei 37 °C, mit Ausnahme von S. salivarius, die 24 Stunden bebrütet werden muss.
7. Falls nötig, überprüfen Sie die Reinheit der Kulturen, bevor Sie die synthetische Gemeinschaft zusammenstellen. Kurz gesagt:
   1. DNA aus den Flüssigkeitskulturen extrahieren und das 16S-rRNA-Gen mit den Primern 27F (AGAGTTTGATYMTGGCTCAG) und 1492R (TACGGYTACCTTGTTACGACT) sowie folgendem Programm: 5 Minuten bei 95 °C, 30 Zyklen à 95 °C für 1 Minute, 55 °C für 1 Minute und 72 °C für 1,5 Minuten, gefolgt von einem letzten Verlängerungsschritt von 5 Minuten bei 72 °C.
   2. Reinigen Sie das Polymerase-Kettenreaktionsprodukt (PCR) mit einem kommerziellen Kit (siehe Materialtabelle) und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.
   3. Durchführung der Sequenzierungsreaktion der gereinigten Produkte in einem Gesamtvolumen von 10 μL mit 0,5 μL Farbstoff (siehe Materialtabelle), 3,2 pmol M13f-Primer (CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC), 2,0 μL 5-fachem Sequenzierungspuffer und 20 ng Schablone unter Verwendung eines kommerziellen Sequenzierungssystems mit Bausatz (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Wir haben diesen Eingriff kommerziell durchführen lassen.
   4. Führen Sie eine BLAST-Suche auf allen Sequenzen (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) durch, um das nächstgelegene bekannte Taxon zu bestimmen, und vergleichen Sie mit der Sequenz des ursprünglichen Stamms mit dem RDP Classifier Online-Tool (http://rdp.cme.msu.edu/) und dem SINA Alignment Service (https://www.arb-silva.de/aligner/).
8. Missen Sie die Zellzahl am Ende der Inkubation mittels Durchflusszytometrie und SYBR Green/Propidiumiodid-Färbung. Verdünnen Sie die Kulturen auf 10⁵ Zellen ^mL-1 mit modifiziertem BHI.
9. Fügen Sie 1 ml S. mitis in 75 ml anaerobe BHI hinzu und inkubieren Sie bis zur stationären Phase (6 H). Anschließend sammeln Sie 0,75 ml jeder verdünnten Stämmung und mischen Sie unter anaeroben Bedingungen.
10. Sobald alle Kulturen vermischt sind, nehmen Sie 1 ml Mikrokosmos und fügen Sie dem 75 ml BHI hinzu. Inkubieren Sie die synthetische Gemeinschaft unter 10 %_CO2, 10 % Wasserstoff (H₂), 80 % N für 48 Stunden bei 37 °C und 200 U/min (siehe Materialtabelle).
11. Messen Sie die Zelldichte wie in 2.8. bevor die Gemeinschaft dem Zellmodell vorgestellt wird. Die Zusammensetzung der Gemeinschaft kann mit quantitativem Echtzeit-PCR bewertet werden. Zusätzlich sollte 16S rRNA-Gen-Amplicon-Sequenzierung verwendet werden, um Informationen über die ersten vorhandenen Mitglieder bereitzustellen. Für beide identitätsbestätigenden Protokolle verwenden Sie cDNA als Vorlage, um die aktiven Proteine zu transkribieren, und DNA als Vorlage, um das Vorhandensein oder Fehlen der Stämme zu erkennen.

3. Allgemeine Zellkulturpraktiken

HINWEIS: Zelllinien aus der Europäischen Sammlung authentifizierter Zellkulturen (Caco-2 ECACC 86010202 und HT29-MTX-E12 ECACC 12040401, Public Health England, Großbritannien) erhalten. Reagenzien für die Zellkultur können erworben werden (siehe Materialtabelle), sofern nicht anders angegeben.

1. Pflege und Weitergabe von Caco-2- und HT29-MTX-ZelllinienHINWEIS: Caco-2- und HT29-MTX-Zellen werden routinemäßig in 25 cm^² großen Gewebekulturkolben mit ergänzendem Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) gezüchtet (Tabelle 1). Zellen werden trypsinisiert, wenn 60–70 % Konfluenz erreicht ist.
   1. Entferne das Zellkulturmedium aus den Kolben. Waschen Sie zweimal mit 5 ml PBS ohne Kalzium/Magnesium (Ca^++/Mg^++).
   2. Fügen Sie 2 ml einer 0,5 mg/L Lösung von Trypsin und 0,22 g/L Ethylendiamin-Tetraessigsäure (EDTA) hinzu. Verteile die Trypsinlösung, indem du den Kolben vorsichtig bewegst. Entfernen Sie 1,5 ml der Trypsinlösung und inkubieren Sie den Kolben bei 37 °C für 10 Minuten.
   3. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob die Zellen von der Oberfläche des Kolbens gelöst sind. Inkubiere bei Bedarf weitere 5 Minuten.
   4. Gib 5 ml ergänzendes Zellkulturmedium in die Flasche, um das Trypsin zu inaktivieren. Pipette hoch und runter, um eine homogene Einzelzell-Suspension zu erhalten.
   5. Sofort nehmen Sie ein 50 μL Aliquot der Zellsuspension und mischen Sie es mit steriler 0,4%iger Trypan-Blau-Lösung im Verhältnis 1:1 (v/v) für Caco-2-Zellen oder 1:5 v/v für HT29-MTX. Mischen Sie durch Pipetteren und laden Sie sie in eine Zählkammer (siehe Materialtabelle).
   6. Zählen Sie die lebensfähigen Zellen (White Bright Cells) unter dem Mikroskop (siehe Herstelleranweisungen).
   7. Säen Sie in einer neuen Flasche mit einer Dichte von 4 x 10⁵ Zellen^/cm2 und 1 x 10⁴ Zellen/^cm2, für Caco-2 bzw. HT29-MTX.
      HINWEIS: (1) Caco-2-Zellen differenzieren sich und bilden enge Übergänge, sobald sie die Zusammenfluss erreichen. Es ist äußerst wichtig, eine Überkonfluenz vor der Trypsinisierung zu vermeiden. Ein Überwuchern der Zellen im Kolben kann nach Trypsinisierung und/oder Verklumpung der Zellablösung versagen. (2) HT29-MTX-Zellen sind schleimproduzierende Zellen mit hoher metabolischer Aktivität. Diese Merkmale können eine schnelle Versauerung des Zellkulturmediums verursachen, insbesondere wenn die Zellen hoch dicht sind. Der 4-(2-Hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonsäurepuffer (HEPES) kann dem Zellkulturmedium (Tabelle 1) hinzugefügt werden, um den pH-Wert zwischen 7 und 7,2 zu halten. Wenn der pH-Wert sinkt, kann das Medium ausgetauscht werden, wenn die Konfluenz unter 50 % liegt. Bei einer Konfluenz >50 % muss die Zellkultur gespalten werden.

4. Zusammenstellung eines Multikompartiment-Zellmodells, das die Darm-Wirt-Mikroben-Schnittstelle simuliert

HINWEIS: Schließen Sie die Kokultur in Doppelkammerbohrungen ab (Durchmesser 24 mm, Porengröße 0,4 μm; siehe Materialtabelle).

1. Fügen Sie 1,5 ml vollständiges Zellkulturmedium zum apikalen Kompartiment und 2 ml zum Basal hinzu. Vorinkubieren Sie 20–30 Minuten, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellsuspension beim Aussaat zu erreichen.
2. Trypsinisiere die Zellkultur von Caco-2 und HT29-MTX, wie in Abschnitt 3 beschrieben. Das Trypsinisierungsverfahren muss genau befolgt werden, um eine homogene Verteilung beider Zelllinien in einer einzigen Zellsuspension ohne Klumpen zu erreichen.
3. Zähle die lebensfähigen Zellen wie in 3.1.8 beschrieben.
4. Stellen Sie die Zelldichte auf 6,5 x 10^{4 Zellen} /cm^² in einem Verhältnis von 90/10 der Caco-2/HT29-MTX-Zellen an.
5. Homogenisieren Sie die Zellsuspensionen und fügen Sie das entsprechende Volumen der Caco-2- und HT29-MTX-Zellen in einen vorgefüllten sterilen Behälter mit ergänzten Zellkulturmedien hinzu. Entfernen Sie das vorinkubierte Medienmaterial von der apikalen Seite der Kammer durch Aspiration.
6. Die Zellsuspension wird vorsichtig durch Pipettieren gemischt und 1,5 ml in das apikale Fach der Kammereinsätze übertragen. Das Aussaatverfahren erfordert eine ständige Homogenisierung der Zellsuspension, da die Zellen dazu neigen, zu sedimentieren. Je nach Erfahrung und Arbeitsgeschwindigkeit muss die Zellsuspension nach der Dosierung von 1–3 Brunnen gemischt werden.
7. Bewege die Platten vorsichtig vorwärts und vorwärts und dann von rechts nach links (5–10 Mal), um eine gleichmäßige Zellverteilung im Brunnen zu erreichen. Übertragen Sie sie in den Inkubator und wiederholen Sie die Bewegung der Platten.
8. Die Kokultur der Caco-2/HT29-MTX-Zellen für 15 Tage aufrechterhalten, wobei apikale und basale Kompartimente alle 2 Tage mit ergänztem DMEM erneuert werden. Nach dieser Zeit kann das Zellkulturmedium durch ein supplementiertes DMEM ohne antibiotische oder antimykotische Lösung umgewandelt werden.
9. Halten Sie das System bis 20–21 Tage nach der Aussaat aufrecht, indem Sie das Medium alle 2 Tage erneuern.
10. Missen Sie vor Beginn des Tests die Integrität der Epithelbarriere mit einem elektrischen Widerstandssystem (siehe Materialtabelle) und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.
    1. Stellen Sie sicher, dass das transepitheliale elektrische Widerstandsgerät (TEER) vor Beginn der Messungen vollständig aufgeladen ist (>24 Stunden).
    2. Trennen Sie das TEER-Gerät vom Netzteil und decken Sie es mit einem Plastik-Autoklavbeutel ab. Mach ein Loch in die Tasche, um die Elektrode einzuführen, und stecke sie in den Eingangsanschluss des Messgeräts. Sprühe mit 70 % Ethanol/Wasser (v/v) ein, bevor du die TEER-Geräte in den Durchflussschrank einbringst.
    3. Um die Elektrode zu desinfizieren, tauchen Sie die Elektrodenspitzen für 15 Minuten in eine 70%ige Ethanol/Wasser-Lösung (v/v) ein. 15 Sekunden an der Luft trocknen lassen. Spülen Sie die Elektrode in vorgewärmtem Zellkulturmedium.
    4. Nimm die Zellen aus dem Inkubator und lass die Zellen im Flow Cabinet auf Raumtemperatur kommen.
    5. Stelle sicher, dass das Messgerät vom Ladegerät getrennt ist. Stelle den Modusschalter auf Ohm und schalte den Power-Schalter ein.
    6. Messen Sie den Zellwiderstand, indem Sie die Elektrode mit der kürzeren Spitze in den Einsatz und der längeren Spitze aus dem Bohrloch eintauchen. Halte die Elektrode in einem 90°-Winkel zum Platteneinsatz.

5. Bakterielles Überleben nach in-vitro gastrointestinalen Transitzuständen

HINWEIS: Bereiten Sie alle Verdünnungen mit ultrareinem Wasser vor. Filtersterilisieren Sie alle Lösungen durch einen 0,22-μm-Filter und führen Sie das Verdauungsverfahren unter sterilen Bedingungen durch.

1. Orale Verdauung:
   1. Geben Sie 3 ml der bakteriellen Gemeinschaft in ein 50 mL steriles Rohr, mischen Sie es mit 3 ml simulierter Speichelflüssigkeit (SSF), die (in mmol ^L-1): Kaliumchlorid (KCl), 15,1 enthält; Kaliumdihydrogenphosphat (KH₂PO₄), 3,7; Natriumbicarbonat (NaHCO₃), 6,8; Magnesiumchloridhexahydrat [MgCl₂(H₂O)₆], 0,5, Ammoniumcarbonat [(NH₄) CO₃], 0,06; Salzsäure (HCl), 1,1; Calciumchlorid-Dihydrat [CaCl₂(H₂O)₂], 0,75. Fügen Sie 75 U/mL α-Amylase aus menschlichem Speichel Typ IX-A und 2 g/L Mucin aus dem Schweinemagen Typ II in die SSF hinzu.
   2. Die Mischung 2 Minuten bei 37 °C und 100 U/min inkubieren. Nehmen Sie eine 2-mL-Probe zur DNA-Extraktion und zur Quantifizierung der Flusszytometrie (S1).
2. Magenverdauung:
   1. Fügen Sie 4 ml simulierte Magenflüssigkeit (SGF) hinzu, die (in mmol L-1): KCl, 6,9; KH₂PO₄, 0,9; NaHCO₃, 25; Natriumchlorid (NaCl), 47,2; MgCl₂(H₂O)₆, 0,1; (NH₄)CO₃, 0,5; HCl, 15,6; CaCl₂(H₂O)₂, 0,075. Zusätzlich enthielt das SGF 2 g/L Mucin aus dem Schweinemagen Typ II.
   2. Messen Sie den pH-Wert und stellen Sie den pH-Wert 3 mit 1 M HCl ein, falls nötig. Inkubieren Sie bei 37 °C und 100 U/min. Nehmen Sie eine 2-mL-Probe (S2).
3. Verdauung des Dünndarms:
   1. Fügen Sie 4 ml simulierte Darmflüssigkeit (SIF) hinzu, die (in mmol L-1): KCl, 6,8; KH₂PO₄, 0,8; NaHCO₃, 85; NaCl, 38,4; MgCl₂(H₂O)₆, 0,33; HCl, 8,4; CaCl₂(H₂O)₂, 0,3, in den Verdauungsschlauch.
   2. Einstellen Sie auf pH 7 mit 1 M NaOH, falls nötig. Inkubieren Sie bei 37 °C und 100 U/min. Nehmen Sie eine 2-mL-Probe (S3).

6. Bakterielle Kolonisationsfähigkeit nach in vitro gastrointestinalen Transitbedingungen

1. Zentrifugiere 2 ml der Dünndarmverdauung für 10 Minuten bei 2.650 x g.
2. Entfernen Sie das Supernatant und mischen Sie das bakterielle Pellet mit 5 ml supplementiertem DMEM ohne Antibiotika und Antimykotika.
3. Färben und quantifizieren Sie intakte/beschädigte Zellen mit einem Durchflusszytometer (siehe Materialtabelle).
4. Stellen Sie die Zelldichte auf 10^{5 lebensfähige} Zellen/ml ein, indem Sie in supplementiertem DMEM ohne Antibiotika und Antimykotika verdünnen.
5. Entfernen Sie das apikale Medium des Transwell-Systems und fügen Sie 1,5 ml bakterielle Suspension hinzu. Kokultur des Systems für 2 Stunden unter allgemeinen Zellkulturbedingungen (37 °C, 95 % Luftfeuchtigkeit, 5 % CO2_).
   HINWEIS: Diese Zeit kann je nach erforderlichem experimentellen Protokoll auf bis zu 48 Stunden verlängert werden. Die Kokultur kann in einem anderen Brutkasten aufrechterhalten werden als bei der routinemäßigen Zellpflege, um Kontaminationen zu vermeiden.
6. Missen Sie die TEER-Werte nach der Inkubation, um die Integrität der Epithelbarriere gemäß 4.11 zu bewerten.
7. Nach Abschluss der Inkubationszeit wird apikales Medium entfernt und 0,5 ml für weitere Analysen gesammelt (S4). Eine Teilprobe des Mediums kann zur Beurteilung der Zellviabilität mittels Laktatdehydrogenase-(LDH)-Assay (siehe Materialtabelle) verwendet werden, entsprechend den Anweisungen des Herstellers.
8. Fügen Sie 0,5 ml 10 mM N-Acetylcystein in HBSS (NAC-Puffer) hinzu, um den durch HT29-MTX produzierten Schleim zu lösen und die haftenden Bakterien wiederherzustellen. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C für 1 Stunde unter Rührung (135 U/min, siehe Materialtabelle).
9. NAC-HBSS wird in einem Mikrozentrifugenröhrchen (S5) gewonnen und die Zellen zweimal mit 1 ml DPBS gewaschen.
10. Fügen Sie 0,5 ml 0,5 % Triton X-100 (w/v) auf die Monoschichten hinzu, stören Sie die Zellen durch Pipetten, holen Sie die Flüssigkeit zurück und vortexen Sie für 1 Minute. Schnelligkeit ist entscheidend, um die bakteriellen Zellen durch das Waschmittel nicht zu schädigen.
11. Zentrifugieren Sie die Zellen für 5 Minuten bei 2.650 x g und trennen Sie das Überstandsmittel (S6) und das Pellet (S7).

7. Stichprobenanalyse

HINWEIS: Analysieren Sie die gesammelten Proben (S1-S7), um die bakterielle Lebensfähigkeit und das Adhäsionspotenzial an die Darmzellen nach einer simulierten gastrointestinalen Verdauung zu bewerten.

1. Bakterielle Lebensfähigkeit: Proben S1-S5 zweimal durch einen 0,45-μm-Filter führen und bakterielle Zellen mittels Färbung von lebenden und toten Zellen sowie Durchflusszytometrie quantifizieren, wie in Schritt 2.8 angegeben.
2. Adhäsionspotenzial: Bereite serielle Verdünnungen (-1 bis -8) für S1-S6 vor und streake 10 μL in Blutagar und modifizierten BHI-Platten. Inkubieren bei 37 °C unter anaeroben Bedingungen für 24–48 Stunden. Platte das gleiche Volumen unverdünntes S7.
   1. Taxonomische Identifizierung haftender Bakterien:
      1. Wähle einzelne Kolonien mit einer Kulturschleife aus und suspendiere jede in 10 μL nukleasefreiem Wasser. Sammeln Sie 4 μL dieser Suspension und verwenden Sie sie als Vorlage für die PCR-Amplifikation des 16S-rRNA-Gens unter Verwendung der in 2.7.1 beschriebenen Primer und Bedingungen.
      2. Führen Sie die Sequenzierung nach dem Protokoll in 2.7.3 durch und validieren Sie die Sequenz mit dem in 2.7.4 enthaltenen Verfahren.
3. Führen Sie weitere nachgelagerte Analysen durch, wie vollständige DNA-Extraktion, qPCR-Quantifizierung und/oder 16S-rRNA-Amplicon-Sequenzierung, RNA-Extraktion und transkriptomisches Profiling nach Bedarf.
   HINWEIS: Die Quantifizierung der Durchflusszytometrie erfolgte unmittelbar nach der Probenahme. Als Kontrolle für membranpermeabilisierte Zellen wurde eine Probe verwendet, die 3 Minuten lang 70 °C ausgesetzt war. Das Hintergrundrauschen wurde bewertet, indem mit Durchflusszytometrie die Verdauungsflüssigkeiten oder Proben aus dem Zellkulturmodell ohne Bakterien gemessen wurden. Jede Probe wurde dreifach vermessen.

 

Tabelle 1: Beschreibung der Zelllinien und der Medienzusammensetzung zur Erhaltung der Zellkultur.

Zellkultur	Adhärent/ Aussetzung	Kultivierungsmedium	Allgemeine Ergänzungen	Spezifische Ergänzungsmittel	Verdopplungszeit	Brutbedingungen
Caco-2 (ECACC 86010202)	Anhänger	Dulbeccos modifiziertes Eagle Medium (DMEM) mit 4,5 g/L Glukose	Inaktiviertes fetales Rinderserum (10 % v/v) Penicillin (100 U/mL)* Streptomycin (0,1 mg/mL)* Amphotericin (0,0025 mg/mL)*	Glutamax (4 mM), nicht-essentielle Aminosäuren (1 % v/v), Pyruvat (1 mM)	65–72 Uhr	95 % Luftfeuchtigkeit und 10 %CO2 CO2-Inkubator (siehe Materialtabelle)
HT29-MTX (ECACC 12040401)	Anhänger			HEPES (1 mM)	20–24 Uhr
* Antibiotika und Antimykotika wurden zwei Tage vor Beginn der Tests aus dem Zellkulturmedium entfernt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
SPANNUNGEN
Aggregatibacter actinomycetemcomitans	Sammlung der amerikanischen Typkultur	ATCC 43718
Fusobacterium nucleatum	Sammlung der amerikanischen Typkultur	ATCC 10953
Porphyromonas gingivalis	Sammlung der amerikanischen Typkultur	ATCC 33277
Prevotella intermedia	Sammlung der amerikanischen Typkultur	ATCC 25611
Streptococcus mutans	Sammlung der amerikanischen Typkultur	ATCC 25175
Streptococcus sobrinus	Sammlung der amerikanischen Typkultur	ATCC 33478
Actinomyces viscosus	Sammlung der amerikanischen Typkultur	ATCC 15987
Streptococcus salivarius TOVE-R
Streptococcus mitis	Sammlung der amerikanischen Typkultur	ATCC 49456
Streptococcus sanguinis	BCCM/LMG-Bakteriensammlung	LMG 14657
Veillonella parvula	Leibniz-Institut DSMZ – Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen	DSM 2007
Streptococcus gordonii	Sammlung der amerikanischen Typkultur	ATCC 49818
ZELLLINIEN
Caco-2-Zellen	Europäische Sammlung authentifizierter Zellkulturen	86010202
HT29-MTX-Zellen	Europäische Sammlung authentifizierter Zellkulturen	12040401
REAGENZIEN UND VERBRAUCHSGÜTER
Brain Heart Infusion (BHI) Brühe	Oxoid	CM1135
Blood Agar 2	Oxoid	CM0055	Blood Agar-Medium
Menadione	Sigma	M9429
Hemin	Sigma	H9039
5 % steriles, defibriniertes Pferdeblut	E&O Laboratories Ltd,	P030
InnuPREP PCRpure Kit	Analytik Jena	845-KS-5010250	PCR-Reinigungskit
Big Dye	Angewandte Biosysteme	4337454	Farbstoff für die Sequenzierung
ABI Prism BigDye Terminator v3.1 Zyklus-Sequenzierungskit	Angewandte Biosysteme	4337456
SYBR Green I	Invitrogen	S7585
Propidiumiodid	Invitrogen	P1304MP
T25-Kulturflaschen unbeschichtet, Zellkultur behandelt, entlüftet, steril	VWR	734-2311
Trypsin-EDTA-Lösung	Sigma-Aldrich	T3924-100ML
Trypan Blue Lösung 0,4 %, flüssig, steril gefiltert	Sigma-Aldrich	T8154
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Gibco	14190250
DMEM-Zellkulturmedien mit GlutaMAX und Pyruvat	Lebenstechnologien	31966-047
Corning Transwell Polyestermembran-Zellkultur-Einsätze	Sigma-Aldrich	CLS3450-24EA
Mucin aus dem Schweinemagen Typ II	Sigma-Aldrich	M2378
Inaktiviertes fetales Rinderserum	Greiner Bio One	758093
Antibiotikum-Antimykotikum (100X)	Gibco	15240062
Triton X 100 für Molekularbiologie	Sigma-Aldrich	T8787
DPBS ohne Kalzium, Magnesium	Gibco	14190-250
Pierce LDH Zytotoxizitäts-Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	88953
Corning HTS Transwell-24-Bohrloch, Porengröße 0,4 μm	Corning Costar Corp	3450
Nukleasefreies Wasser	Serva-Elektrophorese	28539010
AUSRÜSTUNG
Neubauer Zählkammer verbessert	Carl Roth	T729.1
BD Accuri C6 Durchflusszytometer	BD Biosciences	653118
PowerLyzer 24 Homogenizer	MoBio	13155
T100 Thermocycler	BioRad	186-1096
Spülsystem	Maßgefertigt	-
InnOva 4080 Inkubator-Shaker	New Brunswick Scientific	8261-30-1007	Shaker für 2.10
Memmert CO₂-Inkubator	Memmert GmbH & Co.	ICO150med
Millicell ERS (elektrisches Widerstandssystem)	EMD Millipore, Merck KGaA	MERS00002
Millipore Milli-Q akademisches, ultrareines Wassersystem	Millipore, Merck KGaA	-
Shaker (ROCKER 3D Basic)	IKA	4000000	Shaker für 6.10