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1. Genomische DNA aus Pflanzengewebe mit einem Genomic Extraction Kit isolieren
- Besorge Zitrusblattgewebe, indem du ein ganzes frisches Blatt von einem Zitrusbaum mit einer sauberen Schere abschneidest und das Blatt in eine saubere Plastik-Sandwichtüte legst.
HINWEIS: Der Beutel mit dem Blattgewebe sollte so schnell wie möglich nach der Sammlung in einen 4 °C-Kühlschrank oder in einem isolierten Behälter auf Eis gestellt werden, um Verderb zu vermeiden. - Gib eine kleine Menge flüssigen Stickstoffs hinzu, um einen Mörser und Stößel zu kühlen. Während sie kühlen, schneiden Sie mit einer Schere ein kleines Stück Blattgewebe von etwa 2,5 cm Größe heraus. Lege das abgeschnittene Gewebe in den Mörtel, um es sofort einzufrieren. Fügen Sie bei Bedarf mehr flüssigen Stickstoff hinzu.
HINWEIS: Isolierte Handschuhe sollten beim Umgang mit flüssigem Stickstoff immer getragen werden. - Mahlen Sie das Pflanzengewebe schnell mit dem Mörtel zu einem feinen Pulver. Mahlen Sie weiter, bis der flüssige Stickstoff vollständig verdampft ist und ein feines grünes Pulver übrig bleibt.
- Kühlen Sie einen Metallpfannenwender kurz in flüssigem Stickstoff für 10 bis 15 Sekunden und schöpfen Sie dann das gemahlene Gewebe im Mörtel in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenrohr mit dem Spatel.
- Fügen Sie 600 μL Nuclei-Lysis-Lösung hinzu (siehe Materialtabelle) mit einer 1000-μl-Pipette. Die Probe 1 bis 3 Sekunden vortoben lassen und dann 15 Minuten in einem 65 °C warmen Wasserbad inkubieren.
- Gib 3 μL RNase-Lösung mit einer 10μL-Pipette zum Lysat, drehe das Rohr 2–5 Mal um, um es zu mischen, und brüte bei 37 °C 15 Minuten in einem Kabineninkubator.
HINWEIS: Lassen Sie die Mischung auf Zimmertemperatur abkühlen, bevor Sie fortfahren. - Fügen Sie 200 μL Protein-Ausfällungslösung hinzu, wirbeln Sie 20 Sekunden lang mit hoher Geschwindigkeit, dann zentrifugieren Sie 3 Minuten bei 13.000 x g, um ein festes Pellet zu formen. Während die Probe zentrifugiert wird, geben Sie 600 μL Isopropanol bei Raumtemperatur in ein frisches 1,5-mL Mikrozentrifugenrohr.
- Mit einer 1000-μl-Pipette wird das Überstandsmittel vorsichtig aus der Zentrifugationsprobe entfernt und in das frische 1,5-mL-Mikrozentrifugenrohr mit Isopropanol übertragen. Das Pellet kann nun entsorgt werden.
HINWEIS: Vermeiden Sie es, das Supernatant mit Protein zu kontaminieren, indem Sie eine winzige Menge Supernatant über dem Pellet lassen. - Invertiere das Röhrchen, bis die DNA als Masse fadenartiger Stränge sichtbar wird, und zentrifugiere dann bei 13.000 x g für 1 Minute bei Raumtemperatur.
- Dekantieren Sie das Supernatant, geben Sie 600 μL 70% Ethanol zum Pellet, wenden Sie das Rohr mehrmals um, um die DNA zu reinigen, und zentrifugieren Sie bei 13.000 x g für 1 Minute.
- Saugen Sie vorsichtig das Ethanol ab, lassen Sie das lose DNA-Pellet stehen, öffnen und wenden Sie das Rohr um, das auf saugfähigem Papier ruht. 15 Minuten bei Zimmertemperatur an der Luft trocknen.
- Geben Sie 100 μL DNA-Rehydrationslösung zur getrockneten DNA-Pellet und inkubieren Sie die DNA dann 1 Stunde lang in einem 65 °C starken Wasserbad, während Sie regelmäßig durch Klopfen auf das Rohr mischen.
- Geben Sie 1 μL gereinigtes Wasser in eine Mikrocuvette und führen Sie es in ein Spektrophotometer ein, um es als Blank zu verwenden. Berechnen Sie die vorhandene DNA-Konzentration, indem Sie 1 μL der Probe in die Mikrocuvette legen und sie in das Spektrophotometer einsetzen. Die DNA-Konzentration (ng/μL) kann als (A260 - A320) × Verdünnungsfaktor × 50 ng/μL berechnet werden.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden. Die Probe kann bei 4 °C gelagert werden.