Dieses Video demonstriert die Herstellung von Influenza-Pseudoviren in menschlichen Zellen mittels Kalziumphosphat-vermittelter Plasmidtransfektion, wodurch die sichere Erzeugung von Einzyklus-Viruspartikeln für nachgeschaltete Anwendungen wie Antikörperneutralisationsassays unter Bedingungen der Biosicherheitsstufe 2 ermöglicht wird.
Methodenartikel
Herstellung von Pseudoviren mittels Plasmid-Transfektion in menschlichen Zellen
59 Aufrufe
⸱
31. August 2026
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Protokoll
1. Verpackung von Pseudoviren mittels Calciumphosphat-Transfektion
- Stellen Sie Einzelzell-Suspensionen von HEK293FT-Zellen (9 x 105 pro mL) in komplettem DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) her (Tabelle 1). Geben Sie 10 mL der Einzelzell-Suspension in einen T75-Flasche und inkubieren Sie die Zellen 20 h vor der Transfektion in einem 37 °C, 5 % Kohlendioxid (CO2) enthaltenden Inkubator.
HINWEIS: Es wird empfohlen, HEK293FT-Zellen mit niedriger Passagezahl (<20 Passagen) zu verwenden. Stellen Sie sicher, dass die Zellmonoschicht 80–90 % konfluent ist. - Ersetzen Sie das Medium 2 h vor der Transfektion durch 10 mL frisches komplettes Medium, das Chloroquin (100 µM) enthält.
- Mischen Sie die Reagenzien und die Plasmid-DNA wie in Tabelle 2 und Abbildung 1 dargestellt: ddH2O (doppelt destilliertes Wasser), pCMV/R-HA, pCMV/R-NA, pHR-Luc, pCMV Δ8.9, 2,5 M CaCl2 (Calciumchlorid) und 2x 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES)-Puffer. Pipettieren Sie die Mischung vorsichtig fünfmal auf und ab; inkubieren Sie die Mischung 20 min bei Raumtemperatur (RT).
- Geben Sie die Mischung in das Medium über den Zellen und schwenken Sie den Kolben vorsichtig. Inkubieren Sie die Zellen im Zellinkubator für 15 h.
- Ersetzen Sie das Medium durch 15 mL frisches komplettes DMEM-Medium. Inkubieren Sie die Zellen in einem 37 °C, 5 % CO2 enthaltenden Inkubator für 65 h.
HINWEIS: Die Farbe des Mediums wird hellorange oder leicht gelb sein, und mindestens 80 % der Zellen sollten unter dem umgekehrten Lichtmikroskop den zytopathischen Effekt (CPE) zeigen. - Sammlen Sie das Überstand, zentrifugieren Sie es 20 min bei 2095 x g und 4 °C. Sammeln Sie den Überstand, portionieren Sie ihn und lagern Sie ihn bei -80 °C.
Tabelle 1: Zusammensetzung des vollständigen DMEM-Mediums.
| Zusammensetzung des vollständigen DMEM-Mediums | Konzentration |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | 1x |
| Fötales Rinderserum | 10% |
| Penicillin (1 U/mL)/Streptomycin | 1 μg/ mL |
Tabelle 2: Pseudovirus-Verpackungssystem.
| Materialien | Konzentration | Volumen |
| 2x HEPES (pH 7.1) | -- | 675,0 µL |
| CaCl2 (2,5 M) | -- | 67,5 µL |
| ddH2O | -- | 529,2 µL |
| pCMV Δ 8,9 | 1000 ng/µL | 18,9 µL |
| pCMV/R-HA | 100 ng/µL | 27,0 µL |
| pCMV/R-NA | 50 ng/µL | 13,5 µL |
| pHR-Luc | 1000 ng/µL | 18,9 µL |
Ergebnisse
Abbildung 1: Ablaufdiagramm der Kalzium-vermittelten Transfektion. Dieses Ablaufdiagramm dient zur Beschreibung der wichtigsten Schritte der Kalzium-vermittelten Transfektion.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Calciumchlorid, wasserfrei | AMRESCO | 1B1110-500G | Reagenz |
| Chloroquin-Diphosphat | Selleck | S4157 | Reagenz |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12100-046 | Reagenz |
| Fötales Rinderserum | Gibco | 16000-044 | Reagenz |
| HEK293FT | Gibco | R700-07 | Zelllinie |
| HEPES-FREIE SÄURE | AMRESCO | 0511-250G | Reagenz |
| ELISA für HIV-1 p24-Antigen | ZeptoMetrix | 801111 | Reagenzkit |
| Gefrierschrank-Packung für Luciferase-Assay-System | Promega | E4530 | Reagenzkit |
| Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 mL | Thermo fisher scientific | 509-GRD-Q | Verbrauchsmaterial |
| Nunc-Kegelzentrifugenröhrchen 15 mL | Thermo fisher scientific | 339650 | Verbrauchsmaterial |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Reagenz |
| Pipettenspitzen (10 μL) | Thermo fisher scientific | TF102-10-Q | Verbrauchsmaterial |
| Pipettenspitzen (100 μL) | Thermo fisher scientific | TF113-100-Q | Verbrauchsmaterial |
| Pipettenspitzen (1000 μL) | Thermo fisher scientific | TF112-1000-Q | Verbrauchsmaterial |
| Serologische Pipetten (5 mL) | Thermo fisher scientific | 170355N | Verbrauchsmaterial |
| Serologische Pipetten (10 mL) | Thermo fisher scientific | 170356N | Verbrauchsmaterial |
