Potato-Virus-X-basiertes MicroRNA-Silencing in Kartoffelpflanzen

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Zhao, J., et al. Kartoffelvirus-X-basierte microRNA-Silenzierung (VbMS) in Kartoffel. J. Vis. Exp. (2020).

Dieses Video zeigt die Verwendung von Agrobacterium tumefaciens, um einen auf dem Kartoffelvirus X (PVX) basierenden Konstrukt in im Reagenzglas gezüchteten Kartoffelpflanzen zur virusbasierten microRNA-Silenzierung (VbMS) einzubringen. Die Methode ermöglicht die systemische Unterdrückung einer Ziel-microRNA und erlaubt es Forschern, deren Rolle in der Pflanzenentwicklung anhand beobachtbarer phänotypischer Veränderungen zu untersuchen.

Protokoll

1. Führen Sie den PVX-basierten VbMS-Assay in Kartoffelpflanzen durch.

Pflanzen Sie 4 Wochen alte in-vitro-Kartoffelpflanzen in Erde um. Die umgepflanzten Pflanzen werden 3–4 Tage später dem VbMS-Assay unterzogen.
Inokulieren Sie Kartoffelpflanzen mit Agrobacterium, das die PVX-STTM (Short Tandem Target Mimic)-Plasmide enthält.
HINWEIS: Für den VbMS-Assay an Kartoffeln werden Agrobacterium-vermittelte Infiltration und Inokulation durch Zahnstocherkratzen gleichzeitig durchgeführt.
1. Entnehmen und inokulieren Sie positive Transformanten, die PVX-STTM-Vektoren enthalten, in 50 mL flüssiges LB-Medium mit 50 μg/mL Kanamycin und 50 μg/mL Rifampicin. Inkubieren Sie im 28 °C-Warmwasserschüttler bei 220 U/min für 16 h, bis OD₆₀₀ = 1,0 erreicht ist.
2. Streichen Sie gleichzeitig die positiven Agrobacterium-Kolonien auf mindestens zwei neue LB-Platten mit 50 μg/mL Kanamycin und 50 μg/mL Rifampicin und inkubieren Sie bei 28 °C für 1 Tag. Fügen Sie den PVX-LIC-Vektor als Kontrolle und PVX-GFP zur Überwachung der Virusausbreitung hinzu.
3. Sammeln Sie die flüssige Agrobacterium-Kultur durch Zentrifugation bei 3.400 x g für 10 min bei Raumtemperatur. Resuspendieren Sie die Agrobacterium-Zellen in einem gleichen Volumen Infiltrationspuffer (10 mM MgCl₂, 10 mM MES und 200 µM Acetosyringon, pH = 5,6) und stellen Sie auf OD₆₀₀ = 1,0 ein. Inkubieren Sie 6 h bei Raumtemperatur.
4. Infiltrieren Sie die Agrobacterium-Kultur mit einer 1-mL-kanülenlosen Spritze in die abaxiale Seite vollständig entfalteter Blätter.
  1. Drehen und halten Sie ein Blatt mit einer Hand, stützen Sie dann mit einem Finger die Blattlamina von der adaxialen Seite an der Infiltrationsstelle ab. Halten Sie die Spritze mit der anderen Hand senkrecht zur Blattoberfläche und infiltrieren Sie die Agrobacterium-Kultur in die abaxiale Seite der Lamina.
5. Entfernen Sie die Agrobacterium-Kultur von den LB-Platten und kratzen Sie mit einem Zahnstocher die Stängeloberfläche des ersten oder zweiten Internodiums der infiltrierten Kartoffelpflanzen an. Kratzen Sie die Epidermis des Stängels vorsichtig an. Vermeiden Sie, durch den Stängel zu stechen, da dies zu schweren Schäden an den Pflanzen führen kann.
Ziehen Sie die infiltrierten Pflanzen bei 22 °C mit einem 16-h-Licht/8-h-Dunkel-Photoperiod und einer Lichtintensität von 120 μmol/m²∙ s¹ im Gewächshaus.
HINWEIS: Phänotypen, die durch miRNA-Silencing verursacht werden, treten gewöhnlich 2–4 Wochen nach der Inokulation auf (Abbildung 1, Abbildung 2). Für das Auftreten des VbMS-Phänotyps nach Infiltration sind typischerweise 10–20 Tage erforderlich. Der VbMS-Phänotyp hängt von den Eigenschaften der spezifischen miRNA und Zielgene, Wachstumsbedingungen und Kartoffelsorten ab.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Abbildung 1: VbMS von miR165/166 in der tetraploiden Kartoffelsorte Katahdin. Phänotypen der Kartoffelpflanzen (Katahdin), die den PVX-Vektor-Kontrollstamm oder PVX-STTM165/166 exprimieren. Magentafarbene Pfeile zeigen ektopisch gebildete B...