Herstellung von Kryoschnitten der Mausretina zur Untersuchung der retinalen Permeabilität für adeno-assoziierte Viren

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Vacca, O., et al. Verwendung von adeno-assoziierten Viren als Werkzeug zur Untersuchung retinaler Barrieren bei Krankheiten. J. Vis. Exp. (2015)

In diesem Video wird das schrittweise Verfahren zur Herstellung von Kryoschnitten der Mausretina zur Visualisierung der Permeabilität von adenoassoziierten Viren über gestörte Retinaschranken hinweg demonstriert.

Protokoll

Alle Verfahren, die tierische Proben betreffen, wurden von dem zuständigen Tierversuchsethik-Ausschuss geprüft und genehmigt.

Für Netzhaut-Cryoschnitte (Abbildung 1), enukleierte Augen präparieren, um Linse und Hornhaut zu entfernen, und durch Eintauchen 1 Stunde lang in 4 % Paraformaldehyd fixieren.
1. Die zuvor fixierten Augen zur Kryoprotektion 1 Stunde lang in 10 % Saccharose bei Raumtemperatur, anschließend 1 Stunde lang in 20 % Saccharose bei Raumtemperatur inkubieren. Kryoprotektion in 30 %iger Saccharoselösung über Nacht bei 4 °C durchführen. Augenschalen einfrieren und in Einbettungsharz wie Cryo-Matrix einbetten. 10 µm dicke Cryoschnitte anfertigen und auf speziell behandelte Objektträger aufbringen, die für Gefrierschnitte geeignet sind und die Gewebeadhärenz während der Färbung verbessern.
2. Schnitte mit 0,1 % Triton X-100 in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) pH 7,4 5 Minuten lang permeabilisieren. 2-mal mit PBS waschen und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in PBS mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1 % Tween 20 blockieren.

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Ergebnisse

Abbildung 1: Schematische Darstellung des allgemeinen Protokolls. Nach der Herstellung von adenoassoziierten Viren (AAV) werden die Partikel in das Glaskörperwasser oder in die Penisvene injiziert, um erwachsene Mäuse zu anästhesieren. Fundus...