Herstellung von Kryoschnitten der Mausretina zur Untersuchung der retinalen Permeabilität für adeno-assoziierte Viren

Zusammenfassung

Quelle: Vacca, O., et al. Verwendung von adeno-assoziierten Viren als Werkzeug zur Untersuchung retinaler Barrieren bei Krankheiten. J. Vis. Exp. (2015)

In diesem Video wird das schrittweise Verfahren zur Herstellung von Kryoschnitten der Mausretina zur Visualisierung der Permeabilität von adenoassoziierten Viren über gestörte Retinaschranken hinweg demonstriert.

Protokoll

Alle Verfahren, die tierische Proben betreffen, wurden von dem zuständigen Tierversuchsethik-Ausschuss geprüft und genehmigt. 

1. Für Netzhaut-Cryoschnitte (Abbildung 1), enukleierte Augen präparieren, um Linse und Hornhaut zu entfernen, und durch Eintauchen 1 Stunde lang in 4 % Paraformaldehyd fixieren.
   1. Die zuvor fixierten Augen zur Kryoprotektion 1 Stunde lang in 10 % Saccharose bei Raumtemperatur, anschließend 1 Stunde lang in 20 % Saccharose bei Raumtemperatur inkubieren. Kryoprotektion in 30 %iger Saccharoselösung über Nacht bei 4 °C durchführen. Augenschalen einfrieren und in Einbettungsharz wie Cryo-Matrix einbetten. 10 µm dicke Cryoschnitte anfertigen und auf speziell behandelte Objektträger aufbringen, die für Gefrierschnitte geeignet sind und die Gewebeadhärenz während der Färbung verbessern.
   2. Schnitte mit 0,1 % Triton X-100 in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) pH 7,4 5 Minuten lang permeabilisieren. 2-mal mit PBS waschen und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in PBS mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1 % Tween 20 blockieren.

Ergebnisse

Abbildung 1: Schematische Darstellung des allgemeinen Protokolls. Nach der Herstellung von adenoassoziierten Viren (AAV) werden die Partikel in das Glaskörperwasser oder in die Penisvene injiziert, um erwachsene Mäuse zu anästhesieren. Fundusaufnahmen mit einer Micron-III-Kamera dienen der Verfolgung der Expression des grün fluoreszierenden Proteins (GFP). Das Expressionsmuster von GFP wird an retinalen Kryoschnitten und flachmontierten Netzhäuten mittels Immunhistochemie und konfokaler Mikroskopie analysiert. Der Übergang der AAV durch die Blut-Retina-Schranke (BRB) wird durch eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) an Blutproben von intravitreal oder intraperitoneal injizierten Mäusen überprüft, um die Anwesenheit der GFP-Sequenz nachzuweisen, die auf das Vorhandensein von AAV-Partikeln im Blutkreislauf hinweist.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Cryomatrix-Einbettungsharz	Thermo Scientific	6769006
Superfrost-plus-Haftobjektträger	Thermo Scientific	10143352
Stereo-Vergrößerungslupe SZ76	ADVILAB	ADV-76B2	Zoom 0,66 x 5 x LEDs mit Stativ, Episkop- und Durchlichtbeleuchtung / Netzhaut-Dissektion
Federschere gerade – 8,5 cm	Bionic France S.a.r.l	15003-08	Netzhaut-Dissektion