AAV-vermittelte Genübertragung zur Visualisierung einer beeinträchtigten Integrität der Netzhautmembran

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Vacca, O., et al. Adeno-assoziiertes Virus als Werkzeug zur Untersuchung retinaler Barrieren bei Erkrankungen. J. Vis. Exp. (2015).

Dieses Video demonstriert die Methode der AAV-vermittelten Genübertragung in der Netzhaut einer transgenen Maus, gefolgt von der Gewebedissektion und Färbung zur Beurteilung der Integrität der inneren Limitansmembran.

Protokoll

Alle Verfahren, die tierische Proben betreffen, wurden von dem zuständigen Tierversuchsethikgremium geprüft und genehmigt.

1. Immunhistochemie

Für Netzhaut-Flachpräparate (Abbildung 1) fixieren Sie enukleierte Augen 15 min lang in 4 % Paraformaldehyd, um die Dissektion zu erleichtern.
1. Dissezieren Sie die Augen innerhalb von 15–30 min, um die Hornhaut und die Linse zu entfernen. Lösen Sie die Netzhaut vom retinalen Pigmentepithel (RPE) und der Sklera, indem Sie rund um die Ora serrata und den Sehnerv schneiden. Tauchen Sie in 4 % Paraformaldehyd für weitere 30 min ein, um die Netzhaut und das fluoreszierende Protein in transduzierten Netzhautzellen zu fixieren (die Fixierung darf 24 h nicht überschreiten). Waschen Sie 5 min in steriler PBS, pH 7,4.
2. Wechseln Sie die phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) in Blockierpuffer (PBS mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA), 2 % normalem Ziegen- oder Essserum, 0,5 % Triton X-100) und inkubieren Sie im Blockierpuffer entweder 4 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C.
Inkubieren Sie die Gewebe mit Primärantikörpern in Blockierpuffer entweder 4 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C. Waschen Sie 3× mit PBS.
HINWEIS: Die verwendeten Antikörper sind wie folgt: Anti-Laminin (1/1.000) zur Markierung der ILM (innere Begrenzungsmembran), Anti-Rhodopsin-Klon 4D2 (1/500) zur Markierung von Stäbchen, Anti-Glutaminsynthetase-Klon GS-6 (1/1.500) zur Markierung von Müllerzellen, Erdnussagglutinin (PNA)-Lektin (1/40) zur Markierung von Zapfen.
Inkubieren Sie die Gewebe mit einer 1:500 verdünnten, mit Alexa Fluor markierten sekundären Antikörperlösung im Blockierpuffer 1 h (Kryoschnitte) bzw. 2 h (Flachpräparate) bei Raumtemperatur und lichtgeschützt. Waschen Sie 3× mit PBS.
Führen Sie Entlastungsschnitte an der Netzhaut durch und montieren Sie sie flach auf einen Objektträger, wobei entweder die Photorezeptor- oder die Seite der retinalen Ganglienzellen (RGC) nach oben zeigt. Geben Sie wässriges Einbettmedium hinzu, setzen Sie ein Deckglas auf und lagern Sie bei 4 °C.
Führen Sie die konfokale Mikroskopie an einem Laser-Scanning-Konfokalmikroskop durch. Akquirieren Sie die Bilder sequenziell zeilenweise, um Übersprechen zwischen Anregung und Emission zu reduzieren. Definieren Sie die Schrittweite gemäß dem Nyquist-Shannon-Abtasttheorem. Verwenden Sie Belichtungseinstellungen, die überbelichtete Pixel in den endgültigen Bildern minimieren. Bearbeiten Sie 12-Bit-Bilder mit FIJI, projizieren Sie Z-Schnitte auf eine einzige Ebene unter Verwendung der maximalen Intensität in der Z-Projektions-Funktion und konvertieren Sie schließlich in den 8-Bit-RGB-Farbmodus.

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Ergebnisse

Abbildung 1: Schematische Darstellung des allgemeinen Protokolls. Nach der AAV-Produktion werden Partikel in den Glaskörper oder in die Penisvene injiziert, um erwachsene Mäuse zu betäuben. Fundusaufnahmen mit einer Micron-III-Kamera dienen ...