Herstellung und Reinigung rekombinanter Hepatitis-B-Viruspartikel

Zusammenfassung

Quelle: Nishitsuji, H., et al. Entwicklung eines Hepatitis-B-Virus-Reportersystems zur Überwachung der frühen Phasen des Replikationszyklus. J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video zeigt die Herstellung und Reinigung rekombinanter Hepatitis-B-Viruspartikel, wodurch sichere, replikationsdefiziente Virensuspensionen für die Untersuchung früher Infektionsereignisse sowie für Hochdurchsatz-Screenings zur Identifizierung antiviraler Wirkstoffe ermöglicht werden.

Protokoll

1. Herstellung rekombinanter HBV (Hepatitis-B-Virus), die das Reportergen kodieren

1. Vorbereitung von HepG2-Zellen
   1. Bereiten Sie das Zellkulturmedium (Dulbeccos modifiziertes Eagles Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fetalem Kälberserum (FBS), 100 U/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin und 100 U/ml nicht essentiellen Aminosäuren) vor.
   2. Impfen Sie 4 × 10⁶ HepG2 (Humanes hepatocelluläres Karzinom G2)-Zellen einen Tag vor der Transfektion in einer 10-cm-Kollagen-beschichteten Petrischale mit 10 ml Kulturmedium aus. Inkubieren Sie die HepG2-Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten 5 % CO₂-Inkubator.
      HINWEIS: Wenn ungefähr 4 × 10⁶ HepG2-Zellen in einer 10-cm-Kollagen-beschichteten Schale mit 10 ml Kulturmedium ausgesät werden, erreichen sie am nächsten Tag eine Konfluenz von 70–90 %.
2. Transfektion
   1. Transfizieren Sie HepG2-Zellen mit jeweils 5 µg pUC1.2HBV delta epsilon15 (ein HBV-Replikationsplasmid mit einer Deletion in der Epsilon-Sequenz) und 5 µg pUC1.2HBV/NL15 unter Verwendung eines Transfektionsreagenz gemäß Herstelleranleitung.
   2. Am nächsten Tag entfernen Sie das Kulturmedium und geben 10 ml frisches Kulturmedium hinzu.
   3. Eine Woche nach der Transfektion überführen Sie das Kulturmedium, das das rekombinante HBV enthält, in einen 50-ml-Röhrchen und fahren Sie mit Schritt 1.3.1 fort. Geben Sie 10 ml frisches Kulturmedium in die Schale mit den transfizierten Zellen.
      HINWEIS: Die Produktion des rekombinanten HBV wird über 4 Wochen aufrechterhalten. Das Kulturmedium, das rekombinantes HBV enthält, kann einen Monat lang bei 4 °C gelagert werden.
3. Reinigung des rekombinanten HBV
   1. Entfernen Sie zelluläre Trümmer aus dem Kulturmedium, das rekombinantes HBV enthält, durch Zentrifugation (2.300 × g für 5 min).
   2. Filtrieren Sie das Überstand durch einen 0,45-µm-Membranfilter.
   3. Geben Sie zum Kulturmedium, das rekombinantes HBV enthält, ein gleiches Volumen von 26 % PEG/1,5 M NaCl (Polyethylenglykol 6000: 130 g, NaCl (Natriumchlorid), 49 g, 1 ml 0,5 M EDTA (Ethylenediamintetraessigsäure) pH 8,0 und 5 ml 1 M HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N′-2-Ethansulfonsäure) pH 7,6 in 500 ml) hinzu und mischen Sie vorsichtig. Inkubieren Sie über Nacht bei 4 °C.
   4. Zentrifugieren Sie 20 min bei 2.300 × g und 4 °C.
   5. Entfernen Sie den Überstand und lösen Sie das Pellet in 0,5 ml TNE (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) auf.
   6. Entfernen Sie die Trümmer durch Zentrifugation bei 2.300 × g für 5 min.
   7. Geben Sie 0,5 ml TNE, das rekombinantes HBV enthält, auf 0,8 ml 20 % Saccharose in TNE.
   8. Zentrifugieren Sie 3 Stunden bei 100.000 × g und 15 °C.
   9. Entfernen Sie so viel wie möglich vom Überstand und bewahren Sie das Pellet auf. Resuspendieren Sie es in 1 ml serumfreiem DMEM pro 40 ml Ausgangskulturmedium.
   10. Inkubieren Sie über Nacht bei 4 °C.
   11. Filtrieren Sie durch einen 0,45-µm-Filter. Bereiten Sie Aliquots zu je 0,5 ml vor und lagern Sie bei -80 °C.
       HINWEIS: Wenn eine Kontamination der ursprünglichen Virusprobe mit Reporterprotein beobachtet wird, reinigen Sie das Virus durch Dichtegradienten-Ultrazentrifugation mit 5–30 % Saccharose in TNE bei 100.000 × g für 2 Stunden oder durch CsCl (Cäsiumchlorid)-Dichteausgleichszentrifugation von 1,1–1,6 g/ml bei 150.000 × g für 50 Stunden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Nano-Glo-Luciferase-Assay-Reagenz	Promega	N1110
Penicillin-Streptomycin-Gemischte Lösung	Nacalai tesque	09367-34
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11995065
100 mm/Kollagen-beschichtete Schale	Iwaki	4020-010
Lipofectamine-3000-Transfektionsreagenz	Thermo Fisher Scientific	L3000001
Polyethylenglykol (PEG) 6000	Sigma-Aldrich	81255
Polyethylenglykol (PEG) 8000	Sigma-Aldrich	89510
NaCl	Nacalai tesque	31319-45
0,5 mol/L EDTA-Lösung	Nacalai tesque	06894-14
Tris-HCl	Nacalai tesque	35434-21
Millex-HP, 0,45 μm, Polyethersulfon, Filter	Merck Millipore	SLHP033RS
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Kollagenbeschichtete 96-Well-Platte	Corning	NO3585
HepG2-NTCP1-myc-clone22	-	-
pUC1.2HBV delta epsilon	-	-
pUC1.2HBV/NL	-	-