Rekombinantes Densovirus-vermitteltes Gene Silencing in Mückenlarven

Zusammenfassung

Quelle: Liu, P., et al. Verwendung eines rekombinanten Mücken-Densovirus als Genübertragungsvektor für die funktionelle Analyse von Genen in Mückenlarven. J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video zeigt die Verwendung rekombinanter Mücken-Densoviren, die Mikro-RNAs kodieren, um spezifische Gene in Mückenlarven zu stillen. Infizierte Larven im frühen Entwicklungsstadium produzieren funktionelle Mikro-RNAs, die die Expression von Zielgenen für nachgeschaltete Untersuchungen unterdrücken.

Protokoll

1. Transduktion von Mücken

1. Waschen Sie 100 Larven der ersten Instar von Aedes albopictus dreimal mit entionisiertem Wasser und überführen Sie die Larven anschließend in einen Becher mit 95 mL entionisiertem Wasser. Geben Sie 5 mL der rekombinanten Aedes aegypti-Densovirus-Stämme (rAaeDV) hinzu (endgültige Konzentration von 1,00 × 10¹⁰ Kopien/mL).
2. Inkubieren Sie 24 h bei 28 °C, waschen Sie die Larven dreimal mit entionisiertem Wasser und überführen Sie sie danach zurück in die Platten und füttern Sie sie regelmäßig.
3. Überwachen Sie die Expression des Zielgens in den Larven mittels qPCR oder Western Blot.
   HINWEIS: Die Detektion von Fluoreszenzsignalen kann verwendet werden, um infizierte Larven präziser zu isolieren. Um beispielsweise Fluoreszenzsignale von Larven nach einer Infektion mit einem rekombinanten Virus, das DsRed exprimiert, zu detektieren, können die Larven auf eine Vertiefungsobjektträgerplatte gegeben und alle 8 Stunden bis zu zwei Tage nach der Infektion unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop beobachtet werden. Sobald fluoreszierende Larven detektiert sind, sollten sie in einzelne Kunststofftestbecher separiert werden, um eine anschließende kontinuierliche Beobachtung zu ermöglichen. Larven mit multiplen infizierten Geweben können mit dieser Methode identifiziert werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Zentrifugenmaschine	Thermo Scientific	75004260
Zentrifugensystem	Beckman Coulter	363118
SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)	Beijing Tiangen Biotech	FP205