Visualisierung hitzebehandelter viraler Kapside mittels Transmissionselektronenmikroskopie

Zusammenfassung

Quelle: Moore, M. D., et al. Alternative In-vitro-Methoden zur Bestimmung der strukturellen Integrität viraler Kapside. J. Vis. Exp.(2017).

In diesem Video wird gezeigt, wie gereinigte virale Kapside einer Hitzebehandlung unterzogen, vorbereitet und mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) abgebildet werden, um strukturelle Veränderungen und hitzeinduzierte Schäden sichtbar zu machen.

Protokoll

1. Vorbereitung von TEM-Proben
   1. Beschaffen Sie Netzraster mit Kohlenstoff-Trägerfolie (Nickel), die für die TEM geeignet sind.
      HINWEIS: Konsultieren Sie die zentrale Einrichtung bezüglich empfohlener Reagenzien und deren Handhabung für das Mikroskop der Einrichtung. Stellen Sie sicher, dass die Raster in einer Box mit Trockenmittel oder in einer Vakuumkammer aufbewahrt werden, um eine Belastung durch Feuchtigkeit zu minimieren.
   2. Reißen Sie etwa 5 cm x 5 cm große Stücke Filterpapier ab. Beschaffen Sie Glas-Petri-Schalen und geeignete selbstschließende invertierte Pinzetten, die für die Mikroskopie geeignet sind.
   3. Schneiden Sie etwa ein 2,5 cm x 5 cm großes Stück Paraffinfolie ab. Legen Sie es auf die Laborbank.
   4. Wärmebehandlung von Norovirus-GII.4-Sydney-Kapsiden
      1. Beschaffen Sie gereinigtes menschliches Norovirus-Hauptkapsidprotein (VP1) von GII.4 Sydney (Zugangsnummer: JX459908), das zu Kapsiden assembliert ist. 
         HINWEIS: Die Kapside in der Studie wurden freundlicherweise von R. Atmar (Baylor College of Medicine, Houston, TX) zur Verfügung gestellt.
      2. Verdünnen Sie die Kapside in 10 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) (pH 7,4) auf ein maximales Volumen von 15 µL in einzelnen verschlossenen Polymerase-Kettenreaktions-(PCR-)Röhrchen. Stellen Sie sicher, dass jedes Röhrchen mindestens 600 ng Kapsid enthält. Stellen Sie sicher, dass 600 ng Kapsid pro Behandlungs-Liganden-Kombination vorhanden sind.
      3. Heizen Sie den Thermocycler auf die gewünschte Wärmebehandlung vor. 
         HINWEIS: Für dieses Protokoll wurde eine Behandlung bei 68 °C über unterschiedliche Zeiträume (0–25 min) gewählt.
      4. Heizen Sie einen zusätzlichen Thermocycler auf 4 °C vor, um eine sofortige Abkühlung zu ermöglichen. Geben Sie die Röhrchen mit der Kapsidlösung für die gewünschte Zeit in den Thermocycler. Übertragen Sie sie unmittelbar nach der Erwärmung für 5 min in einen vorgekühlten 4 °C-Thermocycler.
      5. Zentrifugieren Sie kurz, um alle Tropfen an das Röhrchenboden zu bringen.
      6. Pipettieren Sie den gesamten ~15 µL-Tropfen der behandelten Kapsidlösung auf die Paraffinfolie.
   5. Greifen Sie mit der Pinzette an den Rand des Rasters, lassen Sie die Pinzette den Rand umschließen, um das Raster zu halten, und legen Sie das Raster mit der Kohlenstoffseite nach unten auf den Tropfen der behandelten Lösung. Lassen Sie es 10 min inkubieren, damit die Kapside am Raster haften können.
      1. Je nach Reinheit der Kapsidpräparation fügen Sie bei Bedarf Waschschritte mit 10 mM HEPES-Lösung hinzu, in Form von 10–15 µL-Tropfen, die direkt hinter dem behandelten Kapsidtropfen angeordnet werden.
      2. Nach 10 min heben Sie das Raster mit dem Tropfen auf. Halten Sie das Raster nahezu senkrecht zu einem Stück Filterpapier, um den Tropfen abzusaugen. Nehmen Sie den 10–15 µL-Tropfen HEPES-Puffer mit dem Raster auf, halten Sie ihn 30 s, und saugen Sie ihn anschließend mit einem weiteren Stück Filterpapier ab, um zu waschen.
   6. Platzieren Sie einen 15 µL-Tropfen einer 2 %igen Uranylacetat-Lösung auf der Paraffinfolie an einer freien Stelle.
      1. Nehmen Sie den Uranylacetat-Tropfen mit dem Raster auf und halten Sie ihn 45 s. Saugen Sie das Uranylacetat ab und entfernen Sie dabei den Großteil der Lösung. Legen Sie das Raster mit der Kohlenstoffseite nach oben auf ein Stück Filterpapier, wobei darauf geachtet werden muss, dass das Raster nicht aufgrund der Feuchtigkeit an der Pinzette „kleben“ bleibt. Stellen Sie das Filterpapier mit dem darauf liegenden Raster in eine offene Glas-Petri-Schale.
         HINWEIS: Verwenden Sie keine Kunststoff-Petri-Schalen, da die Raster elektrostatisch angezogen werden und an der Schale haften bleiben können.
   7. Wiederholen Sie den Vorgang für alle Behandlungen. Stellen Sie die Hälften der Petri-Schalen mit den Rastern über Nacht in einen Trockner, um sie vor der Beobachtung mit der TEM zu trocknen.
   8. Konsultieren Sie die Mikroskopie-Einrichtung der jeweiligen Institution bezüglich der Beobachtung der vorbereiteten Raster. Einige Einrichtungen erlauben es dem Benutzer, in die Bedienung des Geräts der Einrichtung eingewiesen zu werden. Spezifische Details zur Einrichtung und Beobachtung eines bestimmten Mikroskops liegen außerhalb des Umfangs dieses Artikels.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Vorbereitung von Proben für die Transmissionselektronenmikroskopie
Nickel-Elektronenmikroskopiegitter mit Kohlenstoffträgerfolie	Ladd Research	10880-100
Automatisch schließende Reverse-Mikroskopietweezer	Ted Pella	5372-NM
Qualitatives Filterpapier	Sigma-Aldrich (Whatman)	WHA1002055
Glas-Petri-Schalen	Sigma-Aldrich	BR455743
100 mM HEPES-Stammlösung (pH 7,2)	N/A	N/A
2 % Uranylacetat	N/A	N/A