Bakteriophagen-vermittelte Genübertragung in Spirochäten-Bakterien

Zusammenfassung

Quelle: Eggers, C. H. Phagevermittelte genetische Manipulation des Lyme-Borrelien-Spirochäten Borrelia burgdorferi. J. Vis. Exp. (2022).

In diesem Video wird die Transduktion genetisch veränderter Borrelia-Spirochäten mithilfe von mit Polyethylenglykol präzipitierten, nicht infektiösen Bakteriophagen, die ein Kanamycin-Resistenzplasmid tragen, demonstriert. Nach der Inkubation mit den Bakterien wird die Kultur auf antibiotikahaltigem Medium ausgestrichen. Nur Zellen, die das Plasmid aufnehmen, überleben und bilden Kolonien. Diese Kolonien werden anschließend ausgewählt und in flüssigem, antibiotikahaltigem Medium vermehrt, um eine stabile bakterielle Population, die das Plasmid trägt, für nachgeschaltete Anwendungen zu etablieren.

Protokoll

1. Transduktionsassay nach PEG (Polyethylenglykol)-Präzipitation des Bakteriophagen φBB-1

1. Vorbereitung B. burgdorferi Kulturen, die als Empfänger in Transduktionsassays verwendet werden sollen. Basierend auf der bestimmten Dichte berechnen Sie das Volumen der Empfängerkultur, das erforderlich ist, um 15 mL einer 1 × 107 Spirochäten·mL−1
2. Zentrifugieren Sie das Kulturvolumen bei 6.000 x g für 10 min. Dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 14,5 mL frischem BSK (Barbour-Stoenner-Kelly).
3. Geben Sie ≤ hinzu500 µL von PEG-präzipitiertem Phagenprobe zur Kultur des Empfängerklons. Gut mischen und bei 33 °C für 72–96 h.
   HINWEIS: Die Menge an Phagen, die während der PEG-Fällung gewonnen wird, kann je nach einer Reihe von Faktoren variieren. Aus einer 15 mL-Kultur der induzierten B. burgdorferi Stamm CA-11.2A, 500 µL enthält typischerweise 50–1.000 infektiöse Phagen28. Volumina der Phagengewinnung ≥500 µL negativ beeinflussen B. burgdorferi Wachstum, wahrscheinlich aufgrund des erhöhten Verhältnisses von SM (Suspensionsmedium) zu BSK.
4. Selektion der Transduzenten durch Festphasenplättierung nach Vermischung mit PEG-präzipitierten Phagen.

2. Selektion der Transduzenten

HINWEIS: Die Festphasenplattierung möglicher Transduzenten erfolgt mithilfe einer Einzelschichtmodifikation des Protokolls. B. burgdorferi-Kolonien wachsen innerhalb des Agars, daher müssen die Proben beim Gießen der Platten dem Medium zugegeben werden, um Transduzenten durch Festphasenplattierung auszuwählen. Diese Technik könnte ebenfalls zur Selektion von Transduzenten geeignet sein, wurde jedoch für diesen Zweck bisher nicht erprobt.

1. Bestimmen Sie die Anzahl der benötigten Platten für die Selektion der Transduktanten basierend auf der Anzahl der Proben aus den Transduktionsassays und Kontrollen, die ausplattiert werden sollen.
   HINWEIS: Üblicherweise werden pro Probe zwei Platten gegossen, eine entspricht etwa 10 % des Kulturvolumens und eine enthält den Rest der Kultur. Gießen Sie zusätzlich Platten als negative Kontrollen, um einzeln zu überprüfen, ob die Phagenpräparation und/oder die als Spender und Empfänger verwendeten Elternklone in Gegenwart des/d er während der Selektion verwendeten Antibiotika(s) wachsen. Es wird außerdem empfohlen, Gießmaterial für mindestens zwei zusätzliche Platten vorzubereiten. Wenn beispielsweise acht Proben und Kontrollen gegossen werden sollen, bereiten Sie genügend Gießmix für 10 Platten vor.
2. Bereiten Sie die Lösungen zum Ausplattieren wie unten beschrieben vor.
   HINWEIS: Jede Platte hat ein Volumen von 30 mL und besteht aus 20 mL 1,5x BSK zum Beimpfen und 10 mL 2,1 % Agarose (Verhältnis 2:1). Dies ergibt eine Platte mit Endkonzentrationen von 1x BSK und 0,7 % Agarose. Zum Beispiel für 10 Platten: Bereiten Sie insgesamt 300 mL Plattierungsansatz vor, bestehend aus 200 mL 1,5x BSK und 100 mL 2,1 % Agarose.
   1. Bereiten Sie 1 L 1,5x BSK unter Verwendung der für 1,5x BSK angegebenen Mengen der einzelnen Komponenten vor. Lagern Sie wie für 1x BSK beschrieben.
   2. Bereiten Sie 2,1 % Agarose in Wasser vor und autoklavieren Sie die Lösung. Verwenden Sie die Agaroselösung frisch oder lagern Sie sie bei Raumtemperatur. Falls bei Raumtemperatur gelagert, erwärmen Sie im Mikrowellenherd mit locker sitzendem Deckel, bis die Lösung vollständig geschmolzen ist, vor der Plattenherstellung.
   3. Bestimmen Sie das Volumen des/der Antibiotika, das/die benötigt wird/werden, um die geeignete Konzentration basierend auf der gesamten Ansäuge-Mischung zu erreichen.
      HINWEIS: Wenn das Gesamtvolumen der endgültigen Auftragungslösung 300 mL beträgt, mischen Sie 200 mL von 1,5x BSK mit einer ausreichenden Menge Antibiotikum, um sicherzustellen, dass die gesamten 300 mL die korrekte endgültige Antibiotikakonzentration aufweisen. Wenn sowohl der Spender als auch der Empfänger im Transduktionsassay unterschiedliche Antibiotikaresistenzgene besitzen, sollte die Auftragungsmischung beide Antibiotika enthalten. Wenn der PEG-präzipitierte Phage vom Spender einen Antibiotikaresistenzmarker codiert und der Empfänger keinen besitzt, sollte die Auftragungsmischung nur das eine Antibiotikum enthalten.
3. Basierend auf der Anzahl der zu gießenden Platten überführen Sie die entsprechende Menge 1,5x BSK und Antibiotika in eine sterile Flasche, die groß genug ist, um die gesamte Gießmischung aufzunehmen. Puffern Sie im Wasserbad bei 56 °C für ≥15 min.
4. Temperieren Sie die geschmolzene Agarose aus dem Autoklav oder der Mikrowelle in einem 56 °C Wasserbad für ≥15 min.
5. Nach der Equilibrierung die bestimmte Menge 2,1 % Agarose zu der Flasche mit 1,5x BSK (mit Antibiotikum) hinzufügen und die Plattierungslösung erneut in das Wasserbad stellen bei 42 °C für 10–15 min.
   HINWEIS: Höhere Temperaturen können die Spirochäten schädigen oder abtöten36. Wenn dasselbe Wasserbad wie zuvor verwendet wird, kühlen Sie das Wasserbad auf 42-45 °C bevor der Timer für die Equilibrierung gestartet wird. Lassen Sie die Plattenlösung nicht equilibrieren bei 42 °C mehr als 20 Minuten, da es sonst beim Gießen der Platten zu verfestigen beginnt.
6. Während der Equilibrierung bereiten Sie die B. burgdorferi Proben, die ausgeplattet werden sollen. Überführen Sie die Menge, die ausgeplattet werden soll, in ein steriles 50-mL-Kegelzentrifugenröhrchen.
7. Wenn eine Menge von weniger als 1,5 mL plattiert wird (<5 % des endgültigen Plattenvolumens von 30 mL) in das neue Röhrchen um und geben Sie die Plating-Mischung direkt zum Probengemisch während des Plattierens hinzu.
   1. Für größere Volumina überführen Sie das gewünschte Kulturvolumen in das neue Röhrchen und zentrifugieren 10 min bei 6.000 x g bei Raumtemperatur. Dekantieren Sie die Überstände bis auf 100–500 µL des Überstandes und verwenden Sie den Rest, um das Pellet vollständig vor dem Ausplattieren zu resuspendieren.
   2. Für Kontrollplatten nach der Co-Kultur ≥107 Zellen der Donator- oder Rezeptorklone in sterile 50-mL-Kegelzentrifugenröhrchen geben. Falls das Volumen über 1,5 mL liegt, zentrifugieren und das Pellet resuspendieren. Falls ein Transduktionsassay mit PEG-präzipitierten Phagen durchgeführt wurde, zusätzlich zur Rezeptorklon 100–250 µL der Phagenprobe in ein steriles 50-mL-Konischgefäß zum Ausplattieren.
8. Nachdem die Plattenlösung bei 42-45 °C 10–15 Minuten lang 30 mL der Übertragslösung in ein Gefäß mit der entsprechenden Probe überführen; die Übertragsmischung und Probe sofort auf eine beschriftete Platte auftragen. Für jede zu übertragende Probe jeweils eine neue Pipette verwenden.
9. Lassen Sie die Platten 15–20 min verfestigen und stellen Sie sie dann in eine 33 °C Inkubator, ergänzt mit 5 % CO₂₂Die Platten nicht umdrehen, solange sie weniger als 48 Stunden nach dem Gießen stehen.
10. Abhängig vom Hintergrund des Empfängerklons überprüfen, ob die Kolonien nach 10–21 Tagen Inkubation auf den Selektionsplatten innerhalb des Agarose erscheinen. Mindestens 5–10 Kolonien, die auf der Platte in Gegenwart beider Antibiotika wachsen, mit einer sterilisierten, mit Watte verschlossenen 5,75-Zoll-Borosilikatpipette aufnehmen und in 1,5 mL 1x BSK mit dem entsprechenden Antibiotikum bzw. den entsprechenden Antibiotika impfen.
11. Kultivieren Sie die inoculierten Kolonien bei 33 °C für 3–5 Tage oder bis sie eine Dichte von etwa 20–40 Spirochäten pro Sichtfeld bei 200facher Vergrößerung in Dunkelfeldmikroskopie erreichen.
    HINWEIS: Nach der Selektion können die Spirochäten zur Langzeitlagerung bei −80 °C durch Mischen eines gleichen Volumens der Kultur mit einer Mischung aus 60 % Glycerin und 40 % 1x BSK, sterilisiert durch Filtration durch eine 0.22 µm Filter

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
15 mL konische Zentrifugenröhrchen (Polypropylen)	USA Scientific	5618-8271
Mitomycin C	Thermo Fisher Scientific	BP25312	ACHTUNG: möglicher Karzinogen; nur in einer Abzugshaube verwenden
Pasteur-Pipetten, 5,75" (mit Watte verschlossen/Borosilikatglas/nicht steril)	Thermo Fisher Scientific	13-678-8A	Vor Gebrauch autoklavieren
50 mL konische Zentrifugenröhrchen (Polypropylen)	USA Scientific	1500-1211
Absolutet Ethanol
Erythromycin	Research Products International Corp	E57000-25.0
Gentamicin-Reagenzlösung	Gibco	15750-060
Glukose (Dextrose, wasserfrei)	Thermo Fisher Scientific	BP350-500
HEPES	Thermo Fisher Scientific	BP310-500
Kanamycin-Sulfat	Thermo Fisher Scientific	25389-94-0