Gentransfer in intestinale Organoide der Maus unter Verwendung von lentiviralen Vektoren

Zusammenfassung

Quelle: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. Protokoll für die lentivirale Transduktion und nachgeschaltete Analyse von intestinalen Organoiden. J. Vis. Exp. (2015)

Dieses Video beschreibt die lentivirale Transduktion von murinen intestinalen Organoiden ausgehend von einer kryptenähnlichen Struktur, die in Suspension vorliegt. Unter Verwendung einer Basalmembran-Matrix als Gerüst und Wachstumsfaktor-supplementiertem Medium werden lentivirale Vektoren eingebracht, um eine stabile Genintegration zu ermöglichen

Protokoll

Lentivirale Transduktion von Organoiden

Tag 0:

1. Teilen Sie zwei Tage vor der Transduktion eine volle 0,95 cm²-Vertiefung mit Organoiden in eine neue Vertiefung, wobei etwa 50 kleine Organoiden angestrebt werden sollen. Teilen Sie die Organoiden (Abbildung 1A, B).
2. Vergesellschaften Sie das Organoid-Kulturmedium mit 10 µM Chir99021 und 10 mM Nicotinamid, um zystische hyperproliferative Krypten zu erhalten (Abbildung 1C).
   HINWEIS: Zystische Krypten entwickeln sich am besten, wenn frisch geteilte Organoiden in Gegenwart von Chir99021 kultiviert werden.

Tag 2:

3. Organoiden durch Auf- und Abpipettieren von Matrigel und Medium gewinnen und dabei das Gemisch mit einer p1000-Mikropipette aufbrechen. Das Gemisch in ein 15-mL-Röhrchen geben.
4. Weiter aufbrechen mithilfe einer Pasteurpipette, deren distale Öffnung durch Schmelzen verkleinert wurde. Die Organoiden 5 min bei 100 x g zentrifugieren, um sie zu pelletieren.
   HINWEIS: Abhängig von der Größe des Zentrifugenrotors kann eine abweichende Zentrifugationsgeschwindigkeit erforderlich sein. Es ist notwendig, die exakte Geschwindigkeit zu ermitteln, bei der die aufgebrochenen Organoiden von der Mischung getrennt werden.
5. Den Überstand entfernen und 500 µL vorgewärmte 1x-Trypsinlösung (vergleichbar mit 0,25 % Trypsin) hinzufügen. Die Organoiden in Trypsin resuspendieren und 3 min in einem 37 °C warmen Wasserbad inkubieren.
6. Trypsin durch Zugabe von 3,5 mL Zellkulturmedium [Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % Fetal-Kalbs-Serum (FCS), 1 % Penicillin/Streptomycin und Glutamin] inaktivieren. 5 min bei 500 x g zentrifugieren.
7. Den Überstand entfernen, sodass ein Pellet in etwa 20 µL Medium verbleibt. Die Organoiden in dieser geringen Restmenge Medium in einen Brunnen einer 48-Loch-Platte überführen.
8. Hochtitriges Lentivirus in Transduktionsmedium hinzufügen, resuspendieren und mit Schritt 3.10 fortfahren. Bei geringer Transduktionseffizienz.
   HINWEIS: Für eine effiziente Transduktion wird typischerweise ein Aliquot von 250 µL hochtiterhaltigem Lentivirus pro Brunnen mit Organoiden hinzugefügt. Dies entspricht 50 % des gesamten aus einer einzelnen Produktion gewonnenen Lentiviruses.
9. Optional: Um die Transduktionseffizienz zu steigern, eine Spinokulation durchführen, indem die 48-Loch-Platte mit den Organoiden in eine vorgewärmte Zentrifuge bei 32 °C gestellt und 1 Stunde lang bei 600 x g rotiert wird.
10. Das Gemisch aus Organoiden und Virus in den Zellkulturinkubator geben und 1 Stunde bei 37 °C inkubieren, um die Transduktion zu ermöglichen.
11. Optional: Um die Transduktionseffizienz weiter zu erhöhen, die Organoiden zusätzlich 3 Stunden bei 37 °C im Zellkulturinkubator inkubieren.
12. 1 mL Organoidenkulturmedium hinzufügen, das Organoiden-Virus-Gemisch resuspendieren, in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführen und 5 min bei 850 x g in einer Mikrozentrifuge zentrifugieren, um die Organoiden zu pelletieren.
13. Den Überstand entfernen und das Pellet in 20 µL eiskaltem Matrigel resuspendieren. Da das Material sich erwärmt verfestigt, Pipettenspitzen verwenden, die durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren von eiskaltem PBS gekühlt wurden.
14. Den Tropfen in die Mitte eines Brunnens einer 48-Loch-Platte geben und 15 min bei 37 °C im Zellkulturinkubator inkubieren, damit er erstarrt.
15. Nach 15 min vorsichtig 250 µL Organoidenkulturmedium, ergänzt mit 10 mM Nicotinamid, 10 µM Chir99021 und 10 µM Y27632, hinzufügen. Aus kleinen, aufgebrochenen Organoidfragmenten bilden sich innerhalb von 24 Stunden kleine zystische Organoiden.

Tag 5:

16. Erneuern Sie das Medium und ergänzen Sie es mit einer Auswahl an Antibiotika (für Puromycin verwenden Sie 4 µg/mL).

Tag 7:

1. Ersetzen Sie das Medium durch Standard-Organoid-Kulturmedium, ergänzt um ein Selektionsantibiotikum.
   HINWEIS: Die Knospung ist 2–3 Wochen nach dem Entzug von Chir99021 abgeschlossen. Nach der Selektion können Organoiden ohne Selektionsantibiotika kultiviert werden.

Ergebnisse

Abbildung 1: Schema der Lentivirus-Produktion für die Organoid-Transduktion.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Polyethylenimin	Polysciences	23966-2
DMEM-Medium	Lonza	BE12-614F
Fetale Kälberserum	Lonza	DE14-801F
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Glutamin	Invitrogen	25030-024
Matrigel	BD	BD 356231
Advanced DMEM-F12	Gibco	12634-010
N2	Invitrogen	17502-048
B27	Invitrogen	17504-044
N-Acetyl-Cystein	Sigma	A9165-1G
Maus-Egf	Invitrogen	PMG8045
Hepes 1 M	Invitrogen	15630-056
Glutamax 100x	Invitrogen	35050-038
Chir 99021	Axon	1386
Y27632	Sigma	Y0503-5MG
Polybrene	Sigma	107689
Nicotinamid	Sigma	N0636
Trypsin	Lonza	BE02-007E