Nachweis der SMAD-Signalwegaktivierung mittels dualer Adenoviren-Transduktion

Zusammenfassung

Quelle: Chen, H., et al.. Live-Cell-Bildgebung des TGF-β/Smad3-Signaltransduktionsweg in vitro und in vivo unter Verwendung eines Adenovirus-Reportersystems. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Untersuchung der SMAD-Signalwegaktivierung in Brustkrebszellen mittels dualer adenoviraler Infektion. Ein Virus überträgt ein konstitutiv exprimiertes GFP-Gen, während das andere einen RFP-Reporter unter einem SMAD-sensitiven Promotor trägt. Nach Stimulation mit TGF-Beta werden SMAD-Proteine aktiviert und bilden einen Komplex, der die Expression von RFP induziert. Der Nachweis beider Signale in lebenden Zellen bestätigt die Aktivierung des Signalwegs.

Protokoll

1. Doppelte Adenovirus-Transduktion in lebenden Einzelzellen

1. Säen Sie 1,0 - 1,5 x 10⁵ MDA-MB-231-Zellen mit 500 μL Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) Kulturmedium, das 5 % fetalen Kälberserum (FBS) enthält, in jede Vertiefung einer 12-Loch-Platte (35 % Zellkonfluenz, insgesamt 2 Vertiefungen).
2. Infizieren Sie die Zellen mit 75 μL adenoviralem Vektor Ad-CMV-GFP (Titer = 5 x 10⁹ PFU/mL) und 7,5 μL adenoviralem Vektor Ad-CAGA12-Td-Tom (Titer = 5 x 10¹⁰ PFU/mL), um eine Multiplizität der Infektion (MOI) von 2.500 zu erreichen, was eine Infektionsrate von 100 % ermöglicht.
3. Behandeln Sie die Zellen je nach Versuchsansatz mit oder ohne 0,25 μL Transformierendes Wachstumsfaktor-Beta (TGF-β) pro Vertiefung (10 mg/mL im Vorratsansatz, 5 ng/μL als Endkonzentration) unmittelbar nach der Adenovirusinfektion.
4. Stellen Sie die Platte 24 h lang in den Inkubator bei 37 °C mit 10 % CO₂.
5. Untersuchen Sie lebende Zellen mit einem Phasenkontrast-Fluoreszenzmikroskop. Erregen Sie das grün fluoreszierende Protein (GFP) bei 470 nm und das Td-Tomato-Protein bei 554 nm.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DMEM	ThermoFisher	1881024	Vor der Verwendung im 37 °C-Wasserbad erwärmen
Fötales Rinderserum	Scientifix Life	FBS500-S	Vor der Verwendung hitzeinaktivieren
Rekombinantes humanes TGF-β1	PEPROTECH	100-21	In DDW aliquotieren, um eine Endkonzentration von 10 mg/mL zu erhalten
Phasenkontrast-Fluoreszenzmikroskopie	OLYMPUS	IX50
MDA-MB-231	ATCC	CRM-HTB-26
Lösung			Zusammensetzung
FBS-DMEM			5 % hitzeinaktiviertes FBS; 10 μg/mL Penicillin; 100 μg/mL Streptomycin