Multiplexes Fluoreszenz-Imaging von viralen Nukleinsäuren und Proteinen in infizierten menschlichen Lymphozyten

Zusammenfassung

Quelle: Shah, R., et al. Einzelzell-Multiplex-Fluoreszenzbildgebung zur Visualisierung viraler Nukleinsäuren und Proteine sowie zur Überwachung von HIV-, HTLV-, HBV-, HCV-, Zika-Virus- und Influenza-Infektionen. J. Vis. Exp. (2020)

Dieses Video zeigt die gleichzeitige Visualisierung von HIV-1-DNA, RNA und Kapsidprotein in infizierten menschlichen Lymphozyten mittels verzweigter DNA-Hybridisierung und Immunfluoreszenz, wodurch eine detaillierte Analyse der einzelnen Stadien der Virusreplikation in einzelnen Zellen ermöglicht wird.

Protokoll

1. Protein-Immunfärbung: Zum Markieren des/des interessierenden Proteins/Proteine

1. Entfernen Sie PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) und geben Sie 200 µL Blockierpuffer (1% w/v BSA (Rinderserumalbumin), 10% v/v FBS (fetales Rinderserum) in PBS mit 0,1% v/v Tween-20 (PBST)) auf die Deckglasprobe. Inkubieren Sie 1 h bei RT (Raumtemperatur).
2. Entfernen Sie den Blockierpuffer und geben Sie 200 µL primären Antikörper, verdünnt in PBST + 1% w/v BSA, auf die Probe. Inkubieren Sie 1 h bei RT.
3. Waschen Sie den Objektträger zweimal mit PBST je 10 min bei RT unter Schütteln.
4. Geben Sie einen sekundären Antikörper Ihrer Wahl für 1 h bei RT in PBST + 1% w/v BSA auf die Probe.
5. Waschen Sie den Objektträger mit PBST für 10 min bei RT unter Schütteln.

2. Kernfärbung: Kontrastfärbung der Kerne nach der Immunfärbung

1. PBST abgießen und DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindol) oder einen beliebigen Kernfärbefarbstoff für 1 min bei RT auftragen.
2. Den Objektträger zweimal 10 min bei RT unter Schütteln mit PBS waschen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Anti-HCV NS5a-Antikörper	Abcam	ab13833	Maus monoklonal; wirksam mit HCV-Genotypen 1a, 1b, 3 und 4
Anti-HIV-1 p24 monoklonaler Antikörper	NIH AIDS Reagent Program	3537
Anti-Mov10-Antikörper	Abcam	ab80613	Kaninchen polyklonal
Rinderserumalbumin			Blockierendes Reagenz für die Immunfärbung
Zellkulturmedium mit Zusätzen			Medium geeignet für das Zellmodell
Deckgläser
DAPI	ACD Bio		Kernfärbung (RNAscope-Kit von ACD Bio)
Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1X PBS)	Gibco	14190250	Ohne Calcium und Magnesium
Fetales Rinderserum (FBS)			Verwenden Sie spezifisches FBS, abhängig davon, in welchem Serum der sekundäre Antikörper hergestellt wurde (z. B. Ziegen-FBS)
Fisherbrand Colorfrost Plus Objektträger	Fisher Scientific	12-550-17/18/19	Vorgereinigt
Objektträger
Tween-20			Für DNA-Hybridisierungspuffer und PBS-T