Ein High-Throughput-Screen für Biomining Cellulase Aktivität von Metagenombanken

Summary

Dieses Protokoll beschreibt einen hohen Durchsatz Bildschirm für cellulolytische Aktivität von einem metagenomische Bibliothek in Escherichia coli exprimiert. Der Bildschirm ist Lösung und hoch automatisiert und nutzt Ein-Topf-Chemie in 384-Well-Mikroplatten mit dem letzten Auslesen als Extinktionsmessung.

Abstract

Cellulose, die ergiebigste Quelle von organischem Kohlenstoff auf der Erde, verfügt über weit reichende industrielle Anwendungen mit zunehmendem Schwerpunkt auf die Produktion von Biokraftstoffen ^1. Chemische Methoden zu ändern oder zu degradieren Zellulose erfordern in der Regel starke Säuren und hohen Temperaturen. Als solche haben enzymatischen Methoden werden in der biologischen Umwandlung Prozess im Vordergrund. Während die Identifizierung von aktiven Cellulasen aus Bakterien und Pilzen isoliert wurde etwas effektiver, widerstehen die überwiegende Mehrheit der Mikroben in der Natur Labor Anbau. Environmental Genomics, auch als Metagenom, Screening-Ansätze bekannt sind äußerst viel versprechend bei der Überbrückung der Anbau Lücke in der Suche nach neuen Biokonversion Enzyme. Metagenomische Screening-Methoden erfolgreich neuartige Cellulasen aus Umgebungen wieder wie als Böden ^2, Büffel Pansen ³ und die Termiten Enddarm ⁴ mit Carboxymethylcellulose (CMC)-Agarplatten mit Kongorot-Farbstoff (basierend auf der Methode der Teather und Holz ⁵⁾ gefärbt vielfältig. Doch die CMC-Methode in den Durchsatz begrenzt ist, ist nicht quantitativ und manifestiert ein niedriges Signal-Rausch-Verhältnis ^6. Andere Methoden wurden ^7,8 berichtet, aber jeder Verwendung einer Agar-Platte-basierter Assay, was unerwünscht für das Hochdurchsatz-Screening von großen einfügen genomische Bibliotheken ist. Hier präsentieren wir eine Lösung basierende Bildschirm für Cellulase-Aktivität unter Verwendung eines chromogenen Dinitrophenol (DNP)-cellobiosid Substrat ^9. Unsere Bibliothek wurde in den pCC1 Kopierschutz Fosmid zu Assaysensitivität durch Kopienzahl Induktion ¹⁰ erhöhen geklont. Das Verfahren nutzt Ein-Topf-Chemie in 384-Well-Mikroplatten mit der endgültigen Anzeige als Extinktionsmessung zur Verfügung gestellt. Diese Anzeige ist quantitativ, empfindlich und automatisiert mit einem Durchsatz von bis zu 100x 384-Well-Platten pro Tag mit einem Liquid Handler und Platten-Lesegerät mit angeschlossenem Stapelsystem.

Protocol

Bevor dieses Protokoll, müssen Sie Ihre metagenomische Bibliothek in einer 384-Well-Platte-Format gespeichert. In unserer Studie haben wir die pCC1 Kopierschutz Fosmid Vektor in Kombination mit dem Phagen T1-resistente TransforMax EPI300-T1 ^R E. coli-Zellen, da die Bibliothek Host gespeichert und unsere Platten bei -80 ° C ^11.

1. Die Replikation der metagenomische Bibliothek Plates

1. Defrost die Platten mit Ihrer Bibliothek bei 37 ° C für ca. 20 Minuten, oder bis alle Brunnen sind aufgetaut.
2. Verwenden Sie das UV-Licht sterilisiert Funktion auf dem qPix2, um den Roboter für 15 Minuten zu st....

Discussion

Ein hoher Durchsatz-Bildschirm für den schnellen Nachweis von cellulolytische Aktivität aus einer großen einfügen genomischer DNA metagenomische Bibliothek in E. ausgedrückt coli ist in diesem Protokoll beschrieben. Diese Methode ist eine Verbesserung gegenüber dem CMC / Congo Red Assay häufig in der Literatur verwendet. Es ist Lösung, und ermöglicht die Ein-Topf-Chemie-Screening in 384-Well-Platten, mit der endgültigen Ausgabe als Absorptionswerte von einem Platten-Lesegerät ermöglicht für die quantit.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
qPix2	Genetix		mit 384-poligem Gitterkopf
qFill3	Genetix		mit 384-Well-Verteiler
Varioskan	Thermo Fisher Scientific, Inc.
RapidStak	Thermo Fisher Scientific, Inc.		Verbunden mit Varioskan
Micro90 Detergent	Cole-Parmer	18100-00	Verdünnt auf 2% in Wasser
Ethanol	Großer Laborlieferant		Verdünnt auf 80% in Wasser
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378	12,5 mg/ml in Ethanol
LB Brühe, Miller	Fisher Scientific	BP1426-2	25 g/L, autoklaviert
384-Well-Platten mit flachem Boden	Corning	3680
L-(+)-Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256	100 mg/mL in Wasser
Kaliumacetat	Fisher Scientific	P171	50 mM in Wasser, autoklaviert, angepasst auf pH 5,5 mit HCl
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151
Trizma-Hydrochlorid	Sigma-Aldrich	T3253	In TE-Pufferlösung, 100 mM
EDTA-Dinatriumsalz	Sigma-Aldrich	E5134	In TE-Pufferlösung, 10 mM
2,4-Dinitrophenylcellobiosid			Zur Verfügung gestellt von Dr. Steve Withers, UBC
Dimethylsulfoxid	Sigma-Aldrich	D8418