Reinigung von Prototype-Foamy-Virus-Intasomen mittels Größenausschlusschromatographie

Zusammenfassung

Quelle: Mackler, R. M., et al. Herstellung und Reinigung von Prototyp-Foamy-Virus-Intasomen. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video zeigt die Reinigung von Prototyp-Foamy-Virus-(PFV)-Intasomen aus einer gemischten Protein-DNA-Suspension mittels Salzextraktion und Größenauschlusschromatographie, wodurch aktive Komplexe für die nachgeschaltete Analyse erhalten werden.

Protokoll

1. Intasom-Lösung

1. Bereiten Sie zwei Pipettenspitzen mit großem Durchmesser vor, indem Sie 2–4 mm vom Ende einer 200-µL-Spitze mit einer neuen Rasierklinge oder einem Skalpell auf einer sauberen Oberfläche abschneiden. 200 µL Spitze mit einer neuen Rasier- oder Skalpellklinge auf einer sauberen Oberfläche
   HINWEIS: Die Pipettenspitzen werden in den Schritten 1.3 und 1.5 verwendet.
2. Entfernen Sie die Dialyseröhre aus dem Dialysepuffer. Um eine Verdünnung der Intasomprobe mit Dialysepuffer zu vermeiden, der am Ende der Röhre in der Nähe der Klammer verbleiben könnte, entfernen Sie jeglichen überschüssigen Dialysepuffer mit einer Mikropipette und einer kleinen Pipettenspitze. Entfernen Sie die Klammer von einem Ende der Dialyseröhre.
3. Verwenden Sie eine Pipettenspitze mit großem Durchmesser aus Schritt 1.1, um die Probe einschließlich des Niederschlags innerhalb der Dialysehaube in ein 1,5-mL-Röhrchen auf Eis zu überführen. 
   HINWEIS: Das Gesamtvolumen des gewonnenen Materials beträgt typischerweise ~140 µL.
4. Die Probe mit Präzipitat liegt bei 200 mM NaCl; erhöhen Sie die Salzkonzentration durch Zugabe des entsprechenden Volumens einer 5 M NaCl-Stammlösung auf eine Endkonzentration von 320 mM NaCl. Zum Beispiel, für eine Probe von 150 µL, hinzufügen 3.9 µL 5 M NaCl und 1.1 µL ddH₂für ein Endvolumen von 155 µL. Überführen Sie den Eiskübel mit der Probe in einen 4 ˚4 °C-Kühlraum
5. Verwenden Sie eine Pipettenspitze mit großem Durchmesser aus Schritt 1.1, um das Präzipitat durch Pipettieren aufzurühren und zu solubilisieren. Wiederholen Sie dies alle 20 Minuten mindestens eine Stunde lang. Achten Sie darauf, dass sich der größte Teil des Präzipitats in Lösung befindet.
   HINWEIS: Das Pipettieren zur Resuspension des Präzipitats kann eingestellt werden, wenn deutlich ist, dass sich die Menge des Präzipitats zwischen den einzelnen Zeitpunkten nicht mehr merklich verringert. Wenn die virale DNA (vDNA) nicht markiert oder intern markiert ist, reduziert sich das Präzipitat basierend auf visueller Beurteilung um etwa 90 %. Im Fall von Cy5-endmarkierter vDNA wird das Präzipitat lediglich um etwa 20 % reduziert; der größte Teil des Präzipitats mit fluorophor-endmarkierter vDNA löst sich nicht auf. Die Menge an effektiv solubilisiertem Präzipitat ist variabel und sollte empirisch bestimmt werden.

2. Aufreinigung von Intasomen

1. Stellen Sie 250 mL Puffer für die Größenausschlusschromatographie (SEC) (20 mM Bis-tris Propan, pH 7,5, 320 mM NaCl, 10 % Glycerin) her. Sterilfiltern Sie den Puffer mit einer 0,2-µm-Filtereinheit und lagern Sie ihn bei 4 ˚C.
   HINWEIS: Alle Reinigungsschritte werden in einem Kühler bei 4 ˚C durchgeführt.
2. Äquilibrieren Sie eine vernetzte Agarose-SEC-Säule (Durchmesser = 10 mm; Länge = 300 mm; Bettvolumen = 24 mL; Probenvolumen = 25–500 µL; maximale Druckbelastung = 1,5 MPa; Ausschlussgrenze = 4 × 10⁷ Da; trennt Molekülmassen zwischen 5 und 5.000 kDa, siehe Tabelle der Materialien) mit SEC-Laufpuffer bei einer Flussrate von 0,4 mL/min.
   HINWEIS: Diese Reinigung kann an verschiedene Größenausschluss-Säulen angepasst werden, sofern diese in der Lage sind, 300 kDa effektiv von 44 kDa zu trennen, beispielsweise Superose 12 10/300 GL oder Superose 6 Increase. Superose 12 10/300 GL weist eine geringere Auflösung auf, was zu stärkerer Überlappung der Peaks führt. Umgekehrt bietet Superose 6 Increase eine höhere Auflösung und bessere Trennung.
3. Zentrifugieren Sie die Intasom-Probe in einem Mikrozentrifugengerät bei 14.000 × g für 10 min bei 4 ˚C, um verbleibende Präzipitate zu pelletieren. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Geben Sie den Überstand auf eine 200-µL-Injektionsschleife (Schlauch mit einem Fassungsvermögen von ca. 200 µL). Applizieren Sie die Probe auf die SEC-Säule.
   HINWEIS: Kleinere Applikationsvolumina ermöglichen eine höhere Auflösung mittels SEC.
4. Eluieren Sie mit 25 mL SEC-Laufpuffer und sammeln Sie 95 Fraktionen zu je 270 µL. Beobachten Sie, dass das SEC-Chromatogramm drei A₂₈₀/A₂₆₀-Peaks zeigt (Abbildung 1).
   HINWEIS: Der erste Peak sollte ein Aggregat darstellen (~9,0–11,5 mL Elutionsvolumen), gefolgt vom PFV-Tetramer-Intasom-Peak (~12,0–14,75 mL Elutionsvolumen) und dem PFV-IN-Monomer mit freiem vDNA-Peak (~15,0–18,0 mL).

Ergebnisse

Abbildung 1: Größenausschluss-Chromatogramm. Eine PFV-Intasom-Assemblierung wurde mit einer Agarose-SEC-Säule getrennt. Diese Säule ermöglicht die Trennung des Aggregats (1), des PFV-Intasoms, das aus einem Tetramer von PFV IN und zwei vDNA besteht (2), sowie des monomeren PFV IN und vDNA (3). In diesem Beispiel wurde vDNA mit einer internen Cy5-Fluoreszenzmarkierung verwendet, die durch Anregung bei 650 nm detektiert wurde. Die y-Achse zeigt die optische Dichte (OD) in Milli-Absorptions-Einheiten (mAU).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DNA-Oligomere	IDT	N/V	Individuelle DNA-Oligos
NaCl	P212121	RP-S23020
BIS-TRIS-Propan, >=99,0 % (Titration)	Sigma-Aldrich	B6755-500G
Glycerin	Thermo Fisher Scientific	G37-20
Gel-Ladetipps, 1–200 μL	Corning	CLS4853-400EA
Rasierklinge, einseitig, 100/Stk., Packung mit 100 Stück	Fisher Scientific	12-640
Dialysegefässklammern	Spectrum Labs	132734
Dialysegefäss, 6–8 kDa, 10 mm	Spectrum Medical	132645
Superose 6 10/300 GL	GE Healthcare Life Sciences	17517201