Gewinnung viraler RNA für die Analyse mittels Real-Time-quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (qPCR)

Zusammenfassung

Quelle: Suzuki, Y., et al. Messung der Dengue-Virus-RNA im Kulturüberstand infizierter Zellen mittels Echtzeit-quantitativer Polymerase-Kettenreaktion. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Probenvorbereitung für die quantitative PCR-Analyse (Polymerase-Kettenreaktion). Virale Proben und RNA-Standards werden seriell verdünnt, mit einem Proteinase-K-Puffer behandelt und unter kontrollierten Temperaturen inkubiert, um die RNA freizusetzen. Die aufbereitete RNA wird anschließend stabilisiert und zur Quantifizierung der viralen RNA-Mengen gelagert.

Protokoll

1. Aufarbeitung von Virusproben für die RT-qPCR (Echtzeit-quantitative Polymerase-Kettenreaktion)

HINWEIS: Die Schritte 1.1–1.3 müssen in einem生物sicherheitswerkstatt durchgeführt werden. Insbesondere die Handhabung des Kulturüberstandes, der einen infektiösen Virus enthält, muss unter Bedingungen der Bio-Sicherheitsstufe 2 (oder höher) erfolgen.

1. Vermischen Sie 199 μL eines Verarbeitungspuffers mit 1 μL nukleasefreiem Proteinase K.
2. Verdünnen Sie die synthetisierte DENV-(Dengue-Virus-)3’UTR-(Unübersetzte Region-)RNA (Ribonukleinsäure) seriell im Verhältnis 1:10, um mithilfe von Zellkulturmedium (z. B. DMEM (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium), ergänzt mit 10 % fetalem Kälberserum und Antibiotika [DMEM/10 % fetales Kälberserum]), das 40 Einheiten/mL RNase-Inhibitor enthält, einen RNA-Standard mit 5 × 10⁹ bis 5 × 10³ Kopien/μL zu erhalten.
3. Geben Sie jeweils 5 μL des Kulturüberstandes von DENV-infizierten Zellen und des DENV-3’UTR-RNA-Standards mit 5 μL der Verarbeitungspuffer/Proteinase-K-Lösung in 8er-PCR-Streifen (Polymerase-Kettenreaktion) oder eine 96-Well-PCR-Platte. Als Nicht-Vorlage-Kontrolle (NTC) mischen Sie 5 μL Zellkulturmedium (d. h., ohne Virus) mit 5 μL der Verarbeitungspuffer/Proteinase-K-Lösung.
4. Nach einer kurzen Zentrifugation inkubieren Sie die Proben in einem Thermocycler unter folgenden Bedingungen: 1 Zyklus (25 °C für 10 min und 75 °C für 5 min).
HINWEIS: Verarbeitete Proben können bei 4 °C aufbewahrt werden, wenn die Echtzeit-PCR-Analyse am selben Tag durchgeführt wird. Für die Langzeitlagerung sollten die Proben bei -80 °C gelagert werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
SimpliAmp-Thermocycler	Thermo Fisher Scientific	A24811	Vergleichbares Thermocycler-Gerät kann verwendet werden, aber die PCR-Zyklenbedingungen müssen optimiert werden.
Rekombinanter RNase-Inhibitor	Takara Bio. Inc	2313A	40 Einheiten/μL
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	Ein vergleichbarer RNA-Reinigungskit kann verwendet werden.
Proteinase K	Nacalai Tesque	15679-06	>600 Einheiten/mL. Ein vergleichbares Reagenz kann verwendet werden.
MicroAmp Fast Optical 96-Loch-Reaktionsplatte, 0,1 mL	Thermo Fisher Scientific	4346907	Abhängig vom Echtzeit-PCR-Gerät kann eine vergleichbare Platte oder Röhrchen verwendet werden, aber die PCR-Zyklenbedingungen müssen optimiert werden.