Gewinnung von Hepatitis-E-Viruspartikeln aus menschlichen Leberkrebszellen

Zusammenfassung

Quelle: Meister, T. L., et al. Ein Zellkulturmodell zur Herstellung von Hepatitis-E-Virus-Stämmen mit hoher Titerkonzentration. J. Vis. Exp. (2020).

In diesem Video wird der Prozess der Isolierung von Hepatitis-E-Virus-(HEV-)Partikeln aus transfizierten menschlichen hepatzellulären Karzinomzellen demonstriert. Extrazelluläre Viruspartikel werden aus filtrierten Überständen gewonnen, während intrazelluläre Partikel freigesetzt werden, indem die Zellen wiederholten Gefrier-Tau-Zyklen unterzogen werden. Der Lysat wird zentrifugiert, und der Überstand, der HEV-Partikel enthält, wird portioniert und für zukünftige Verwendung bei einer ultratiefen Temperatur gelagert.

Protokoll

1. Vorbereitung von HepG2-Zellen zur Herstellung von zellkulturbasiertem Hepatitis-E-Virus (HEVcc)
HINWEIS: Um Kontaminationen zu vermeiden, wurden die Vorbereitung der Zellen, die Elektroporation, Infektion, Gewinnung und Zellfixierung unter sterilen Bedingungen in einer Sicherheitswerkbank der Sicherheitsstufe 2 durchgeführt. Inkubationsschritte bei 37 °C, an denen Zellen beteiligt waren, erfolgten in einem Inkubator mit 5 % CO₂.

1. Um HepG2-Zellen für die HEVcc-Produktion vorzubereiten (Abbildung 1), säen Sie die Zellen in vollständigem Dulbecco’s modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) (siehe Tabelle 1) auf eine 15 cm große, mit Kollagen beschichtete Kulturschale (siehe Tabelle 1, das sterile gefilterte Puffer-Phosphat-Lösung (PBS)-Essigsäure-Gemisch vor dem Hinzufügen von Kollagen durch ein 0,2-µm-Netz filtern). Inkubieren Sie bei 37 °C, bis die Zellen 90 % konfluent sind.
   HINWEIS: Jede 15 cm große Schale mit 90 % konfluenten Zellen liefert genügend Zellen für bis zu 4 Elektroporationen.
2. Entfernen Sie vorsichtig das Medium von der Schale und waschen Sie die Zellen einmal mit 10 mL 1x PBS. Lösen Sie die Zellen durch Zugabe von 3 mL 0,05 %iger Trypsin-EDTA-Lösung ab und inkubieren Sie bei 37 °C, bis sich die Zellen vollständig gelöst haben. Suspendieren Sie die Zellen in 10 mL vollständigem DMEM und überführen Sie die Zellsuspension in ein 50 mL-Gefäß. Bestimmen Sie die Gesamtanzahl der Zellen.
3. Da jede Elektroporation 5 x 10⁶ Zellen benötigt, überführen Sie das entsprechende Volumen in ein neues 50 mL-Gefäß und ergänzen Sie mit 1x PBS auf mindestens 35 mL. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 5 Minuten und entfernen Sie das Überstandsvolumen vorsichtig, ohne den Zellenpellet zu stören.
4. Waschen Sie die Zellen erneut mit 35 mL 1x PBS bei 200 x g für 5 Minuten. Stellen Sie die Zellen auf Eis und entfernen Sie das 1x PBS noch nicht, um die Zellen in Suspension zu halten.

2. Elektroporation von HepG2-Zellen

1. Für die Elektroporation von HepG2-Zellen (Abbildung 2) bereiten Sie 400 µL vollständiges Cytomix pro Elektroporation vor, indem Sie 384 µL Cytomix (siehe Tabelle 1) mit 2 mM ATP und 5 mM Glutathion ergänzen. Frisch vor der Anwendung herstellen und direkt auf Eis stellen.
   HINWEIS: Eine korrekte und schnelle Durchführung der folgenden Schritte ist entscheidend. Stellen Sie daher sicher, dass alles ordnungsgemäß vorbereitet ist.
2. Entfernen Sie vorsichtig 1x PBS, ohne das Zellpellet aus Schritt 4.4 zu stören. Resuspendieren Sie 5 x 10⁶ Zellen in 400 µL vollständigem Cytomix und geben Sie 5 µg RNA hinzu. Überführen Sie die Lösung in eine 4-mm-Küvette und geben Sie einen Impuls mit 975 µF, 270 V für 20 ms mit einem Elektroporationssystem.
   1. Nach der Elektroporation überführen Sie die Zellen so schnell wie möglich mit einer Pasteurpipette in 11 mL vollständiges DMEM pro Elektroporation.
      HINWEIS: Um sicherzustellen, dass die RNA erfolgreich in HepG2-Zellen transfiziert wurde, wird eine Transfektionskontrolle (TC) durchgeführt. Erwartete Transfektionsraten liegen zwischen 40–60 % ORF2-positiver Zellen.
3. Überführen Sie 10 mL elektroporierte Zellen in eine mit Kollagen beschichtete 10-cm-Kulturschale. Geben Sie 1,3 x 10⁵ elektroporierte Zellen (300 µL) in eine Vertiefung einer mit Kollagen beschichteten 24-Mikrotiterplatte, die einen Deckglaser (später als Transfektionskontrolle verwendet). Verteilen Sie die Zellen gleichmäßig und inkubieren Sie bei 37 °C.
   1. Nach 24 h wechseln Sie das Medium in der 10-cm-Schale und ersetzen es durch 10 mL frisches vollständiges DMEM. Das Medium der Transfektionskontrolle wird nicht gewechselt. Inkubieren Sie weitere 6 Tage bei 37 °C.

3. Gewinnung von intra- und extrazellulären, kultivierten Zellen entstammenden HEV (HEVcc)

1. Um extrazelluläre HEVcc zu gewinnen (Abbildung 3), filtrieren Sie das nach 6 Tagen aus der 10-cm-Schale gewonnene Überstandsmaterial durch einen 0,45-µm-Filter, um Zelltrümmer zu entfernen. Lagern Sie das gewonnene extrazelluläre HEVcc bei 4 °C für eine Infektion am selben Tag; andernfalls bei -80 °C.
2. Um intrazelluläre HEVcc zu gewinnen (Abbildung 3), waschen Sie die Zellen mit 1x PBS und behandeln Sie sie mit 1,5 mL 0,05 %iger Trypsin-Ethylenediamintetraessigsäure (Trypsin-EDTA), um sie abzulösen. Inkubieren Sie bei 37 °C, bis die Zellen vollständig abgelöst sind. Geben Sie 10 mL komplettes DMEM hinzu, spülen Sie die Platte aus, um die Zellen abzulösen, und überführen Sie die Zellsuspension in ein 50-mL-Gefäß. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. Zentrifugieren Sie 5 min bei 200 x g.
   1. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1,6 mL komplettem DMEM pro Elektroporation. Überführen Sie die Zellsuspension in ein 2-mL-Reaktionsgefäß.
      HINWEIS: Verwenden Sie keine größeren Volumina, da dies die Viruslasten drastisch verringern würde.
   2. Tiefgefrieren (in flüssigem Stickstoff) und Auftauen der Zellen. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal.
      HINWEIS: Pools von mehr als einer Elektroporation (1,6 mL) sollten nicht für die drei Gefrier-Tau-Zyklen verwendet werden, da die Lyse-Effizienz beeinträchtigt würde. Vortexen Sie die Zellsuspension zwischen den Zyklen nicht. Achten Sie darauf, die Zellsuspension langsam aufzutauen (z. B. bei Raumtemperatur oder auf Eis), um die Viruslasten zu maximieren.
   3. Zentrifugieren Sie die lysierten Zellen mit hoher Geschwindigkeit 10 min bei 10.000 x g, um Zelltrümmer abzutrennen. Überführen Sie den Überstand in ein neues Gefäß. Verwenden Sie den Überstand für die Infektion; andernfalls lagern Sie ihn bei -80 °C.
   4. Optional können die extrazellulären und intrazellulären HEVcc mithilfe eines Konzentrators angereichert werden, um die Viruslasten zu erhöhen.

Tabelle 1: Tabelle der Pufferzusammensetzung.

Arbeitslösung	Konzentration	Volumen
Kollagen	40 mL	PBS
	40 µl	Essigsäure
	1 mL	Kollagen-R-Lösung 0,4 % steril
Cytomix	120 mM	KCl
	0,15 mM	CaCl2
	10 mM	K2HPO4 (pH 7,4)
	25 mM	HEPES
	2 mM	EGTA
DMEM komplett	500 mL	DMEM
	5 mL	Pen/Strep
	5 mL	MEM NEAA (100X)
	5 mL	L-Glutamin
	50 mL	Fetale Rinderserum
MEM komplett	500 mL	MEM
	5 mL	Natriumpyruvat
	5 mL	Gentamycin
	5 mL	MEM NEAA (100X)
	5 mL	L-Glutamin
	50 mL	ultra-niedriges IgG

Ergebnisse

Abbildung 1: Schematischer experimenteller Aufbau zur Vorbereitung von HepG2-Zellen für die Herstellung von zellkulturgeleiteten HEV (HEVcc).

Abbildung 2: Schematischer experimenteller Aufbau zur Elektroporation von HepG2-Zellen.

Abbildung 3: Schematischer experimenteller Aufbau zur Gewinnung intrazellulärer und extrazellulärer HEVcc.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,45 µm Masche	Sarstedt	83.1826	Extrazelluläres Virus gewinnen
MEM	gibco	31095-029	Zellkultur
MEM NEAA (100×)	gibco	11140-035	Zellkultur
Trypsin-EDTA (0,5 %)	gibco	15400054	Zellkultur
ultra-low IgG	gibco	1921005PJ	Zellkultur
Essigsäure	CarlRoth	6755.1	Kollagen-Arbeitslösung
ATP	Roche	11140965001	In-vitro-Transkription und Elektroporation
BioRender	BioRender		Abbildungserstellung
Calciumchlorid	Roth	5239.2	Cytomix
Kollagen R-Lösung 0,4 % steril	Serva	47256.01	Kollagen-Arbeitslösung
DMEM	gibco	41965-039	Zellkultur
EGTA	Roth	3054.3	Cytomix
GenePulser Xcell Elektroporations-System	BioRad	1652660	Elektroporation
HEPES	Invitrogen	15630-03	Cytomix
Dikaliumhydrogenphosphat	Roth	P749.1	Cytomix
KCL	Roth	6781.3	Cytomix
Monopotassiumphosphat	Roth	3904.2	Cytomix
L-Glutamin	gibco	25030081	Zellkultur
Reduziertes L-Glutathion	Sigma-Aldrich	G4251-5G	Cytomix
MEM	gibco	31095-029	Zellkultur
MEM NEAA (100×)	gibco	11140-035	Zellkultur
Magnesiumchlorid	Roth	2189.2	Cytomix
Mikrovolumentransmissions-UV-Vis-Spektrophotometer NanoDrop One	Thermo Fisher	ND-ONE-W	DNA/RNA-Konzentration
PBS	gibco	70011051	Zellkultur
Pen/Strep	Thermo Fisher	15140122	Zellkultur