Reinigung von Viren aus der Allantoisflüssigkeit von bebrüteten Hühnereiern

Zusammenfassung

Quelle: Yates, J. G. E., et al. Herstellung eines rekombinanten Newcastle-Krankheitsvirus mit hohem Titer aus Allantoisflüssigkeit. J. Vis. Exp. (2022)

Das Video zeigt die Aufreinigung und Konzentrierung von Viruspartikeln aus geklärter Allantoisflüssigkeit, die aus virusinfizierten bebrüteten Hühnereiern gewonnen wurde. Es veranschaulicht eine Reihe von Filtrations- und Trennungsschritten, einschließlich Tiefenfiltration, Querstromfiltration und Dichtegradienten-Ultrazentrifugation, um intakte Viren zu isolieren. Die virusreiche Fraktion wird anschließend dialysiert, um verbleibende Salze und Bestandteile des Gradienten durch Diffusion zu entfernen, gefolgt von einer Konzentrierung mittels einer hypertonen Lösung über Osmose. Das Ergebnis ist eine aufgereinigte, hochtitrige Viruspräparation, die für experimentelle Anwendungen geeignet ist.

Protokoll

1. Amplifizierung von Newcastle-Krankheits-Virus (NDV) unter Verwendung eierlegender Hühner mit angegebener Pathogenfreiheit

1. Inokulation von spezifisch pathogenfreien (SPF) bebrüteten Hühnereiern
   HINWEIS: Typischerweise werden acht Dutzend SPF-bebrütete Hühnereier verwendet, um eine Charge von Newcastle-Krankheitsvirus (NDV) in vivo-Güte zu erzeugen. Bestellen Sie ein oder zwei Dutzend zusätzliche Eier, um Beschädigungen während des Transports sowie Variabilität in der Lebensfähigkeit auszugleichen.
   1. Nach Erhalt der SPF-bebrüteten Hühnereier inkubieren Sie diese in einem Brutkasten bei 37 °C und 60 % Luftfeuchtigkeit für 9 Tage. Stellen Sie sicher, dass der Brutkasten so eingestellt ist, dass die Eier automatisch stündlich geschwenkt/gedreht werden.
      HINWEIS: Die Eier können bis zu 24 Stunden bei Raumtemperatur oder bis zu 72 Stunden bei 4 °C gelagert werden; dies kann jedoch die Lebensfähigkeit der Embryonen verringern.
   2. Nach 8–11 Tagen der Inkubation (idealerweise am Tag 9) die Eier durchleuchten, um die Lebensfähigkeit der Embryonen zu bestimmen. Achten Sie auf netzartige Gefäßstrukturen (Abbildung 1A) und Embryobewegungen als Indikatoren für lebensfähige Embryonen. Entsorgen Sie Eier, die diese Merkmale nicht aufweisen (Abbildung 1B).
   3. Markieren Sie bei den lebensfähigen Eiern die Grenzfläche zwischen Luftsack und Embryo mit einem Bleistift mit einem „X“ (Abbildung 1A). Stellen Sie sicher, dass die Injektionsstelle nicht zur Durchtrennung der Gefäße führt. Stellen Sie die markierten Eier zurück in den Brutkasten, während das Inokulum vorbereitet wird.
   4. Berechnen Sie die Menge an Virus, die erforderlich ist, um alle SPF-bebrüteten Hühnereier zu impfen. Stellen Sie sicher, dass jedes Ei 100 Plaque-bildende Einheiten (PFU) Virus in einem Volumen von 100 µL erhält; verdünnen Sie das Virus in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf eine Konzentration von 1 × 10³ PFU/mL. Bereiten Sie zusätzlich 20 % mehr Inokulum vor, um Ungenauigkeiten bei der Virusapplikation auszugleichen.
   5. Reinigen Sie die Oberseiten der markierten Eier mit einem antistatischen Tuch und einer 10 %igen Jodlösung, die in 70 %igem Ethanol verdünnt wurde. Warten Sie etwa 1–2 Minuten, bis die Lösung getrocknet ist.
   6. Stechen Sie vorsichtig mit einem Paar steriler, scharfer Pinzetten durch die Schale. Desinfizieren Sie die Pinzette zwischen den Eiern in 70 %igem Ethanol.
   7. Injizieren Sie mit einer 1-mL-Spritze und einer 25-G-Nadel 100 µL des in Schritt 1.1.4 vorbereiteten Inokulums in die Chorioallantois-Höhle (Abbildung 1C). Führen Sie die Nadel in einem Winkel von nahezu 90° zur Eieroberfläche ein. Stechen Sie die Nadel gerade in die obere Region der Chorioallantois-Membran.
   8. Nach der Inokulation verschließen Sie die Einstichstelle mit Nagellack und stellen Sie die Eier zurück in den Brutkasten. Stellen Sie sicher, dass die Schwenkfunktion bis 24 Stunden nach der Inokulation aktiviert bleibt.
   9. Überprüfen Sie 24 Stunden nach der Inokulation die Lebensfähigkeit der Eier. Entsorgen Sie tote Eier, bei denen keine Gefäßstruktur in der Chorioallantois-Membran und keine Embryobewegung feststellbar ist (Abbildung 1B).
      HINWEIS: Diese Eier sind aufgrund des Inokulationsvorgangs gestorben und nicht infolge einer NDV-Infektion.
   10. Stellen Sie die Eier zurück in den Brutkasten, wobei die Schwenkfunktion AUSgeschaltet sein muss, um eine Kontamination der Allantois-Flüssigkeit mit Eiweißen zu verhindern.
   11. Überprüfen Sie die Eier alle 12–24 Stunden wie in Schritt 1.1.9 beschrieben, um tote Eier zu identifizieren. Bringen Sie die Eier, die nach 24 Stunden post-Inokulation sterben, auf 4 °C, um die Autolyse zu minimieren. Gewinnen Sie die Allantois-Flüssigkeit innerhalb von 2–12 Stunden nach dem Kühlen.
   12. Inkubieren Sie die Eier mindestens 72 Stunden lang.
       HINWEIS: Bei der Vermehrung eines mesogenen NDV-Stamms beträgt die optimale Inkubationszeit 60–72 Stunden, da längere Inkubationszeiten den Reinigungsprozess beeinträchtigen können, da die Allantois-Flüssigkeit trüber wird. Dieses Problem ist bei lentogenen NDV-Stämmen weniger relevant, da diese viel länger benötigen, um den Embryo zu töten.
   13. Nach der geeigneten Inkubationszeit bringen Sie die verbleibenden Eier vor der Gewinnung der Allantois-Flüssigkeit 2–12 Stunden lang auf 4 °C.
2. Gewinnung der Allantois-Flüssigkeit, die NDV enthält
   1. Bringen Sie die gekühlten Eier in den Sicherheitswerkbank. Reinigen Sie die Oberseiten der Eier mit 70 %igem Ethanol.
   2. Verwenden Sie sterile Pinzetten und chirurgische Schere, um die apikale Seite des Eis, an der sich der Luftsack befindet, zu öffnen.
   3. Entfernen Sie die Schale, um die Chorioallantois-Membran freizulegen (Abbildung 1D).
   4. Stechen Sie vorsichtig die Membran an und ziehen Sie sie zurück, um die Allantois-Höhle freizulegen (Abbildung 1E). Achten Sie darauf, dass der Dottersack nicht versehentlich durchstochen wird, da dies das Ei unbrauchbar macht.
   5. Greifen Sie mit stumpfen Pinzetten den Embryo und öffnen Sie den embryonalen Sack.
      HINWEIS: Die Flüssigkeit im embryonalen Sack enthält ebenfalls NDV.
   6. Drücken Sie den Embryo mit den Pinzetten nach unten und sammeln Sie die Allantois-Flüssigkeit mit einer 10-mL-Serologischen Pipette.
   7. Lagern Sie die Allantois-Flüssigkeit bis zur Klärung auf Eis in 15-mL-Konischen Röhrchen.
      HINWEIS: Wenn die Allantois-Flüssigkeit gelb ist, wurde der Dottersack beschädigt, und die Allantois-Flüssigkeit sollte verworfen werden.
   8. Zentrifugieren Sie die Konischen Röhrchen mit der Allantois-Flüssigkeit bei 1.500 × g für 10 Minuten bei 4 °C.
   9. Pausenpunkt: Aliquotieren Sie die geklärte Allantois-Flüssigkeit in 50-mL-Konische Röhrchen und lagern Sie sie zur Langzeitlagerung (z. B. Wochen bis Monate) bei -80 °C. Ergänzen Sie die Flüssigkeit mit Saccharose auf eine Endkonzentration von 5 %, um das Virus vor den schädlichen Effekten von Einfrieren und Auftauen zu schützen. Alternativ, für die Kurzzeitlagerung (z. B. 1–3 Tage), ergänzen Sie die Allantois-Flüssigkeit mit Saccharose (Endkonzentration 5 %) oder mit 3× Mannit-Lysin (ML)-Puffer (15 % Mannit, 3 % Lysin), um eine Endkonzentration von 1× (5 % Mannit, 1 % Lysin) vor der Lagerung bei 4 °C zu erhalten.

2. Reinigung von NDV aus Allantoisflüssigkeit

1. Tiefenfiltration der Allantoisflüssigkeit
   1. Lagern Sie die geklärte Allantoisflüssigkeit bei -80 °C und tauen Sie sie am Abend vor der Reinigung bei 4 °C auf.
   2. Richten Sie im biologischen Sicherheitswerkbank den Schlauch und die peristaltische Pumpe wie in Abbildung 2 gezeigt ein.
   3. Falls noch nicht erfolgt, mischen Sie die Allantoisflüssigkeit mit 3× ML-Puffer, um eine Endkonzentration von 1× zu erreichen.
   4. Sterilisieren Sie vor dem Anschließen des Tiefenfilters den Schlauch, indem Sie 50 mL einer 0,5 M Natriumhydroxidlösung (NaOH) durch das System in einen Abfallbehälter leiten.
   5. Spülen Sie den Schlauch, indem Sie 100 mL steriles, molekularbiologisches Wasser durch das System und in den Abfallbehälter leiten.
      HINWEIS: Da NaOH NDV inaktiviert, ist es wichtig, dass die Leitungen vor der Zugabe der virushaltigen Allantoisflüssigkeit ausreichend gespült werden.
   6. Primeren Sie das System, indem Sie 50 mL PBS durchlaufen lassen, und stoppen Sie die Pumpe, wenn noch etwa 5 mL PBS im Schlauch verbleiben.
   7. Befestigen Sie einen Tiefenfilter mit einer Rückhaltegröße von 1–3 µm am Schlauch und entfernen Sie die zweite Kappe auf der apikalen Seite des Filters, um diesen zu entlüften. Leiten Sie weitere 50 mL PBS durch das System.
   8. Sobald PBS durch die Entlüftungsöffnung an der Oberseite des Filters fließt, schließen Sie die Öffnung und lassen Sie weiterhin PBS durch die Leitungen fließen.
      HINWEIS: Geringe Luftblasen sind akzeptabel, doch bei größeren Luftmengen muss der Filter erneut gemäß den Schritten 2.1.7 und 2.1.8 entlüftet werden.
   9. Stoppen Sie die Pumpe, wenn noch etwa 5 mL PBS im Schlauch verbleiben.
   10. Ersetzen Sie den Abfallbehälter durch einen neuen, sterilen Sammelbehälter und beginnen Sie, die Allantoisflüssigkeit durch den Tiefenfilter zu leiten.
       HINWEIS: Der Druck sollte 10 psi nicht überschreiten, da dies zu einer Scherbelastung des Virus führt. Der Druck kann durch Verringerung oder Erhöhung der Flussrate der Pumpe reguliert werden. Wenn der Druck 10 psi übersteigt und die Flussrate nicht weiter verringert werden kann, sollte ein neuer Tiefenfilter verwendet werden. In diesem Fall sind die Schritte 2.1.6–2.1.8 erneut durchzuführen, bevor der Durchfluss der Allantoisflüssigkeit fortgesetzt wird.
   11. Nachdem die gesamte Allantoisflüssigkeit den Filter passiert hat, leiten Sie 50 mL 1× ML-Puffer durch die Leitungen, um die Virusausbeute zu maximieren.
   12. Sammeln Sie die Flüssigkeit, bis die Leitungen leerlaufen. Lagern Sie das Virus über Nacht oder bis zu 36 Stunden bei 4 °C.
       HINWEIS: Nach der Tiefenfiltration sollte der Reinigungsprozess innerhalb von 36 Stunden nach Abschluss der Tiefenfiltration fortgesetzt werden.
   13. Trennen Sie den Tiefenfilter ab und desinfizieren Sie die Schläuche, indem Sie 100 mL einer 0,5 M NaOH-Lösung und 400 Teile pro Million (ppm) Bleichmittel, vorgewärmt auf 42 °C, durch das System leiten, bevor Sie das System in 0,5 M NaOH lagern.
2. Tangentialflussfiltration zur Konzentrierung von NDV
   1. Bauen Sie die Komponenten der Kassette wie in Abbildung 3A dargestellt in einer biologischen Sicherheitswerkbank zusammen.
      HINWEIS: Das Manifold und die Endplatte sollten vor der Verwendung mit Reinigungsmittel gewaschen und getrocknet werden. Die Silikondichtungen sind wiederverwendbar und sollten zusammen mit der Kassette in 0,5 M NaOH gelagert werden.
   2. Richten Sie das Tangentialflussfiltrationssystem (TFF) (auch Querstromfiltration genannt) in einer „offenen“ Konfiguration ein (Abbildung 3B).
      1. Wenn die Kassette zum ersten Mal verwendet wird, bauen Sie die TFF-Kassette in der Elutionskonfiguration zusammen und spülen Sie sie mit 100 mL sterilen, molekularbiologischen Wasser durch (Abbildung 3C).
      2. Sobald nur noch 5 mL Wasser im Vorratsbehälter verbleiben, pausieren Sie die Pumpe und ändern Sie die TFF-Systemkonfiguration in eine geschlossene Form (Abbildung 3D).
      3. Geben Sie 100 mL einer 0,5 M NaOH-Lösung und 400 ppm Bleichmittel, vorgewärmt auf 42 °C, in den Vorratsbehälter und lassen Sie die Lösung 30–60 Minuten lang durch das System zirkulieren.
      4. Pausieren Sie den Durchfluss und kehren Sie das TFF-System zur Elutionskonfiguration zurück, indem Sie den Durchfluss fortsetzen, um die Reinigungslösung auszuspülen.
      5. Wenn noch etwa 5 mL im Vorratsbehälter verbleiben, pausieren Sie die Pumpe und geben Sie 100 mL steriles, molekularbiologisches Wasser hinzu, um das System zu spülen.
      6. Wenn noch etwa 5 mL im Vorratsbehälter verbleiben, pausieren Sie die Pumpe und bringen Sie das TFF-System in die offene Konfiguration (Abbildung 3B). Fahren Sie mit Schritt 2.2.3 fort.
   3. Sterilisieren Sie die Kassette und die Schläuche, indem Sie 100 mL einer 0,5 M NaOH-Lösung mit der peristaltischen Pumpe durch das System leiten. Achten Sie darauf, dass der Druck 30 psi nicht überschreitet, um die Integrität der Kassette zu bewahren.
   4. Pausieren Sie die Pumpe, wenn noch etwa 5 mL 0,5 M NaOH im Vorratsbehälter verbleiben.
   5. Geben Sie 100 mL steriles, molekularbiologisches Wasser in den Vorratsbehälter und setzen Sie den Fluss durch die Kassette fort. Schwenken Sie den Vorratsbehälter, um sicherzustellen, dass sämtliches NaOH von den Wänden abgewaschen wird, um eine Inaktivierung des Virus zu verhindern. Wiederholen Sie den Spülvorgang.
   6. Wenn noch etwa 5 mL steriles, molekularbiologisches Wasser im Vorratsbehälter verbleiben, pausieren Sie die Pumpe.
   7. Geben Sie 100 mL PBS in den Vorratsbehälter, schwenken Sie ihn, um sicherzustellen, dass das sterile, molekularbiologische Wasser von den Wänden abgewaschen wird, und setzen Sie den Fluss durch die Kassette fort.
   8. Wenn noch etwa 5 mL im Vorratsbehälter verbleiben, pausieren Sie die Pumpe, geben Sie die tiefengefilterte Allantoisflüssigkeit in den Vorratsbehälter und setzen Sie den Pumpendurchfluss fort.
   9. Überwachen Sie Manometer 1 (Abbildung 3B), um sicherzustellen, dass der Druck 10 psi nicht überschreitet, um eine Schädigung des Virus zu vermeiden. Kombinieren Sie die Drehzahl der peristaltischen Pumpe mit der Verwendung von C-Klammern, um den Abfluss zum Abfall zu erhöhen.
      HINWEIS: Die Kombination aus Pumpendrehzahl und C-Klammern führt zu einem erhöhten Druck.
   10. Wenn noch 50–100 mL Allantoisflüssigkeit im Vorratsbehälter verbleiben, pausieren Sie die Pumpe, um einen Pufferaustausch durch Zugabe von 150–200 mL 1× ML-Puffer durchzuführen.
   11. Setzen Sie den Pumpendurchfluss fort und überwachen Sie erneut Manometer 1 (Abbildung 3B), um sicherzustellen, dass der Druck 10 psi nicht überschreitet.
   12. Wenn noch 5–10 mL im Vorratsbehälter verbleiben, pausieren Sie die Pumpe.
   13. Schließen Sie mit zwei C-Klammern die beiden Abfallleitungen, wie in Abbildung 3C dargestellt.
   14. Trennen Sie die Retentatleitung, die den Vorratsbehälter speist, und führen Sie sie in ein 50 mL kegelförmiges Reagenzglas ein (Abbildung 3C).
   15. Setzen Sie den Pumpendurchfluss fort und pausieren Sie, wenn nur noch wenige Tropfen Flüssigkeit im Vorratsbehälter verbleiben.
   16. Entfernen Sie die C-Klammern von den Abfallleitungen und verbinden Sie die Retentatzufuhrleitung wieder mit dem Vorratsbehälter (Abbildung 3B).
   17. Geben Sie 20–25 mL 1× ML-Puffer hinzu und setzen Sie den Pumpendurchfluss fort, bis noch etwa 5 mL im Vorratsbehälter verbleiben.
   18. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.13 bis 2.2.16.
       HINWEIS: Eine dritte Elution kann durch Wiederholung der Schritte 2.2.17 und 2.2.13 bis 2.2.16 durchgeführt werden, um die Virusausbeute zu erhöhen. Der Großteil des Virus befindet sich jedoch in den ersten beiden Elutionen.
   19. Nach Abschluss der Elutionen lagern Sie das Virus auf Eis oder bei 4 °C.
   20. Um die Leitungen zu reinigen, richten Sie das System so ein, dass es eine geschlossene Schleife bildet (Abbildung 3D), wobei die Abfallleitungen zurück in den Vorratsbehälter führen, wie in Abbildung 3D dargestellt.
   21. Reinigen Sie das System, indem Sie 250 mL einer 0,5 M NaOH-Lösung und 400 ppm Bleichmittel, vorgewärmt auf 42 °C, hinzufügen.
   22. Lassen Sie die Reinigungslösung über Nacht durch das System fließen.
       HINWEIS: Während der Rezirkulation der Reinigungslösung sollte bei einer Pumpengeschwindigkeit von 50 mL/min ein Druck von etwa 5 psi beobachtet werden. Überschreitet der Druck diesen Wert, ist die Kassette verschmutzt, und die Reinigungslösung sollte ersetzt und der Vorgang wiederholt werden.
   23. Eluieren Sie die Reinigungslösung, indem Sie beide Abfallleitungen und die Retentatleitung in einen Abfallbehälter leiten.
   24. Geben Sie 400–500 mL sterilem Wasser in den Vorratsbehälter und leiten Sie es durch das System in die Abfallbehälter.
   25. Wenn noch etwa 5 mL im Vorratsbehälter verbleiben, pausieren Sie die Pumpe und geben Sie 100–200 mL 0,5 M NaOH in den Vorratsbehälter, wobei Sie die Lösung schwenken, um den Behälter zu spülen.
   26. Wenn der Vorratsbehälter fast leer ist, wiederholen Sie Schritt 2.2.23 zwei weitere Male.
   27. Bauen Sie die TFF-Anlage ab und lagern Sie die TFF-Kassette und die Dichtungen in einer geringen Menge 0,5 M NaOH in einem wiederverschließbaren Plastikbeutel bei 4 °C.
       HINWEIS: Die Schläuche können bei Raumtemperatur in 0,5 M NaOH eingetaucht gelagert werden.
3. Ultrazentrifugation über eine Iodixanol-Dichtegradient
   1. Schalten Sie die Ultrazentrifuge ein und stellen Sie sie auf Vorkühlung auf 4 °C ein. Kühlen Sie den gewünschten Rotor ebenfalls auf 4 °C vor (siehe Tabelle der Materialien).
      HINWEIS: Rotoren sollten bei 4 °C gelagert werden.
   2. Verwenden Sie die konzentrierte 60 %ige Iodixanol-Lösung (Konzentration zum Zeitpunkt des Kaufs), um 40 %ige, 20 %ige und 10 %ige Iodixanol-Lösungen herzustellen, indem Sie mit PBS und 3× ML-Puffer auf eine Endkonzentration von 1× ML-Puffer verdünnen.
   3. In einem 13,2 mL fassenden, offenen, dünnwandigen Ultrazentrifugenröhrchen überlagern Sie nacheinander 0,5 mL, 2,5 mL und 2,5 mL der 40 %igen, 20 %igen und 10 %igen Iodixanol-Lösungen (Abbildung 4A).
      HINWEIS: Durch Neigen des Ultrazentrifugenröhrchens zur Seite und langsames Auspressen der Lösung wird das Vermischen der Gradientenschichten erheblich reduziert. Die Trennung der einzelnen Schichten sollte deutlich sichtbar sein, wobei ein „Hof“ zwischen den einzelnen Gradientenschichten erkennbar ist.
   4. Markieren Sie die Grenzflächen der verschiedenen Gradientenschichten mit einem Markierstift.
   5. Schichten Sie 6–6,5 mL des eluierten Virus aus dem TFF-Verfahren vorsichtig über den Dichtegradienten. Fügen Sie das Virus wie in Schritt 2.3.3 beschrieben hinzu, um den Dichtegradienten nicht zu stören.
   6. Platzieren Sie die Ultrazentrifugenröhrchen in die Einsätze des Schwingkopfrotors (siehe Tabelle der Materialien), wobei Sie eine offene Waage verwenden, um die Einsätze auf ein Gewichtsgefälle von maximal 0,01 g auszugleichen. Verwenden Sie PBS oder zusätzliches Viruseluat, um Gewichtsunterschiede auszugleichen.
   7. Nach dem Ausgleich der Röhrchen verschließen Sie diese und laden sie in den Rotor ein.
   8. Zentrifugieren Sie 1,5 Stunden bei 125.000 × g bei 4 °C.
      HINWEIS: Dieser Schritt kann über Nacht durchgeführt werden, falls eine Ultrazentrifuge mit verzögerter Startfunktion verfügbar ist.
   9. Entfernen Sie nach der Ultrazentrifugation die Röhrchen mit sterilen Pinzetten. Suchen Sie die Zielbande, eine breite Bande zwischen den 10 % und 20 % Schichten (Abbildung 4B).
   10. Stellen Sie das Röhrchen mit Hilfe eines Stativs über einen Becher.
   11. Befestigen Sie eine 18 G × 1,5-Zoll-Nadel an einer 5 mL-Spritze und stechen Sie in die Seitenwand des Ultrazentrifugenröhrchens.
       HINWEIS: Das Röhrchen sollte knapp unterhalb der Zielbande durchstochen werden, wobei die Nadel leicht nach oben gerichtet und die Schneide nach oben zeigt, sodass sie in die Zielbande eindringt.
   12. Strecken Sie den Kolben langsam aus, um die Zielbande zu entnehmen.
       HINWEIS: Bewegen Sie die Nadel innerhalb der Zielbande, um die maximale Virusmenge zu gewinnen. Achten Sie darauf, dass keine anderen Banden oder Verunreinigungen mit der Zielbande vermischt werden, und vermeiden Sie, zu viel Flüssigkeit aufzunehmen, da dies zu einem höheren Verbrauch an Dialysekassetten führt.
   13. Nach der Entnahme der Zielbande entfernen Sie die Nadel und lassen die restliche Flüssigkeit in den Abfallbecher ablaufen. Geben Sie die Zielbande in ein 50 mL kegelförmiges Reagenzglas, bis alle Banden aus allen anderen Ultrazentrifugenröhrchen entnommen wurden.
   14. Wiederholen Sie die Schritte 2.3.10–2.3.13, bis alle Zielbanden aus allen Ultrazentrifugenröhrchen entnommen wurden.
   15. Alternative Methode zur Entnahme der Zielbanden gemäß den Schritten 2.3.10 bis 2.3.13
       1. Entfernen Sie die Flüssigkeit oberhalb der Zielbande vorsichtig mit einer Pipette. Sobald Sie die Zielbande erreichen, entnehmen Sie diese mit der Pipette und lagern Sie das Virus in einem 50 mL kegelförmigen Reagenzglas.
          HINWEIS: Dadurch können die Ultrazentrifugenröhrchen wiederverwendet werden.
4. Entfernung von Iodixanol aus der Viruslösung
   HINWEIS: Die NDV-haltige Bande erscheint bei einer Iodixanoldichte zwischen 15 % und 16 %. Die Iodixanol-Konzentration in der Lösung kann durch Messung der Absorption bei 340 nm im Vergleich zu einer Standardkurve bestimmt werden. Dieser Schritt kann entfallen, da bei der Verabreichung von Iodixanol-Lösungen dieser Konzentration an C57BL/6-Mäuse keine nachteiligen Effekte oder akute Toxizität beobachtet wurden.
   1. Befeuchten Sie eine Dialysekassette mit einem Molekulargewichtsabschnitt von 10 kDa (Volumen 0,5–3 mL) vor, indem Sie sie 1 Minute lang in PBS eintauchen.
      HINWEIS: Die Dialysemembran sollte sich von glatt zu wellig oder rau verändern. Falls das Volumen des extrahierten Virus 10 mL überschreitet, sollten zwei 0,5–3 mL Dialysekassetten oder eine 5–12 mL Dialysekassette verwendet werden.
   2. Entnehmen Sie das Virus je nach Bedarf mit einer 5- oder 10-mL-Spritze und einer 18 G × 1,5-Zoll-Blindfüllnadel aus dem 50 mL kegelförmigen Reagenzglas.
   3. Führen Sie die Spritze vorsichtig in die Dialysekassette ein, ohne die Membran zu durchstechen, und injizieren Sie das Virus.
      HINWEIS: Die Dialysekassette kann gedreht werden, um die Position der Luftblase in der Kassette zu verändern. Die Luftblase sollte entfernt werden, bevor die Nadel aus der Kassette gezogen wird.
   4. Füllen Sie einen 1 L-Becher mit steriler 1× PBS, geben Sie einen Rührstab und die Dialysekassette hinein und decken Sie ab. Inkubieren Sie bei 4 °C mit sanftem Rühren.
      HINWEIS: Verwenden Sie extrudierten Polystyrolschaum und ein Gummiband, um die Dialysekassette so zu befestigen, dass sie in der PBS schwimmt. Die Kassette kann aufgrund des ML-Puffers leicht anschwollen.
   5. Nach 1–2 Stunden ersetzen Sie die PBS durch frische 1× PBS und inkubieren Sie weitere 8–10 Stunden bei 4 °C mit leichtem Rühren.
      HINWEIS: Dies kann auch über Nacht erfolgen.
   6. Ersetzen Sie die PBS erneut durch frische 1× PBS und inkubieren Sie bei Raumtemperatur 1–2 Stunden.
5. Konzentrierung der Viruslösung
   1. Entnehmen Sie die Dialysekassette aus dem Dialysepuffer (Abbildung 4C) und legen Sie sie in einen kleinen, verschließbaren Plastikbeutel. Geben Sie 15–25 mL einer 40 %igen Polyethylenglykollösung mit einem Molekulargewicht von 20.000 hinzu, sodass die Dialysekassette vollständig bedeckt ist.
   2. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur unter Schütteln. Überprüfen Sie regelmäßig das Volumen des Virus in der Kassette mit einer 5- oder 10-mL-Spritze und einer 18 G × 1,5-Zoll-Blindfüllnadel.
      HINWEIS: Die zur Konzentrierung benötigte Zeit variiert je nach Ausgangsvolumen und gewünschtem Endvolumen. Typischerweise beträgt das gewünschte Endvolumen unabhängig vom Ausgangsvolumen der Allantoisflüssigkeit zwischen 1 und 1,5 mL. Achten Sie beim Volumenabgleich darauf, nicht denselben Anschluss zu verwenden, da dies die Integrität des Anschlusses beeinträchtigen und zu einer Vermischung der Polyethylenglykollösung mit dem Virus führen kann.
   3. Bevor Sie das konzentrierte Virus aus der Dialysekassette entnehmen, spülen Sie die Kassette kurz mit 1× PBS ab und füllen Sie eine 18 G × 1,5-Zoll-Blindfüllnadel mit Luft.
   4. Führen Sie die luftgefüllte Spritze in die Dialysekassette ein und drücken Sie den Kolben nieder. Drehen Sie die Vorrichtung so, dass das konzentrierte Virus entnommen werden kann, ohne dass die eingebrachte Luft entfernt wird.
   5. Geben Sie das konzentrierte Virus in ein 50 mL kegelförmiges Reagenzglas und notieren Sie das entnommene Volumen.
   6. Verwenden Sie dieselbe Spritze und Nadel, um eine geeignete Menge 60 %igen Saccharose in die Dialysekassette zu injizieren, sodass nach Mischung mit dem zuvor entnommenen Virus eine Endkonzentration von 5 % Saccharose erreicht wird.
   7. Massieren Sie die Membran vorsichtig mit den behandschuhten Fingern, um an der Membran haftendes restliches Virus zu lösen, ohne diese zu beschädigen. Entfernen Sie etwas überschüssige Luft aus der Dialysekassette, um den Lösungsvorgang zu erleichtern.
   8. Mischen Sie diese Waschflüssigkeit mit dem bereits im 50 mL kegelförmigen Reagenzglas befindlichen Virus.
      HINWEIS: Das Virus befindet sich nun in 5 % Saccharose und kann in Aliquots von 20 µL, 50 µL, 100 µL oder 200 µL abgefüllt und bei -80 °C gelagert werden. Alternativ kann NDV zur Langzeitlagerung lyophilisiert und bei 4 °C gelagert werden, wie in Abschnitt 2.6 beschrieben.

Ergebnisse

Abbildung 1: Infektion und Gewinnung von NDV aus spezifisch pathogenfreien bebrüteten Hühnereiern. (A) Nach 9 Tagen Inkubation sollte ein netzartiges Gefäßsystem (Pfeile) sichtbar sein, zusätzlich zur Embryobewegung. 'X' kennzeichnet die Grenzfläche zwischen der Chorioallantoidmembran und der Luftkammer, an der die Bohrung zur Impfung des Eis angelegt werden sollte. (B) Bild eines verendeten Embryos. Beachten Sie das Fehlen des netzartigen Gefäßsystems. Auch das Fehlen von Embryobewegungen wird beobachtet. (C) Schema der Bestandteile eines bebrüteten Hühnereis mit Darstellung der Lage der Luftkammer, des Dottersacks, des Amnionsacks, der Chorioallantoidmembran und der Allantoisflüssigkeit. (D) Entfernen der Schale, um die Chorioallantoidmembran freizulegen. (E) Veranschaulichung des Aussehens von Allantoisflüssigkeit und Embryo nach dem Öffnen der Chorioallantoidmembran. Abkürzung: NDV = Newcastle-Krankheits-Virus.

Abbildung 2: Schematische Darstellung der allgemeinen Montage der Vorrichtung, die für die Tiefenfiltration verwendet wird. Stellen Sie sicher, dass das Manometer stromaufwärts des Tiefenfilters installiert ist.

Abbildung 3: Tangentialstromfiltrationsanordnung in ihren verschiedenen Konfigurationen. Pfeile zeigen die Richtung des Flüssigkeitsstroms an. (A) Darstellung, wie die TFF-Kassette zusammengesetzt wird. (B) Schema des TFF-Systems in seiner „offenen“ Konfiguration, die während der Reinigung und Konzentration der Flüssigkeit verwendet wird. (C) Schema der TFF-Anordnung, wenn Flüssigkeit aus dem System eluiert wird, wie dies während der Elution des Virus und der Reinigungslösung erfolgt. (D) Schema des TFF-Systems in seiner „geschlossenen“ Konfiguration, die während der Reinigung des TFF-Systems verwendet wird. Abkürzung: TFF = Tangentialstromfiltration.

Abbildung 4: Dichtegradient-Ultrazentrifugation und Dialyse des konzentrierten Virus aus der TFF. (A) Schema, das die Zusammensetzung des Iodixanol-Dichtegradienten zeigt. (B) Bandenmuster des Virus nach der Ultrazentrifugation des während des Reinigungsprozesses mit dem ML-Puffer hergestellten Virus. Die Hauptbande, die das Virus enthält, ist durch ein schwarzes Oval gekennzeichnet. (C) Typische Größe einer Dialyseskassette, die mit 10 mL Virus beladen ist, das am Ende des Dialyseverfahrens über einen Iodixanol-Gradienten aufgereinigt wurde. Abkürzung: TFF = Tangential flow filtration; ML = Mannitol-Lysine.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1 mL Slip-Tip-Spritze	BD	309659
10 mL Luer-Lok-Spritze	BD	302995
10 %ige Povidon-Jod-Lösung	LORIS	109-08
Kegelförmige 15 mL-Röhrchen	Thermo-Fisher	14955240
18G × 1 1/2 Zoll stumpfe Füllnadel	BD	305180
18G × 1 1/2 Zoll Precision Glide-Nadel	BD	305196
25 G × 5/8 Zoll Nadel	BD	305122
5 mL Luer-Lok-Spritze	BD	309646
Eisessig	Thermo-Fisher	A38-212
Agarose	Froggabio	A87-500G
Alexa-Fluor 488 Ziege-Anti-Maus	Invitrogen	A11001
Allegra X-14 Zentrifuge	Beckman Coulter	B08861
Ammoniumpersulfat	BioRad	161-0700
Chlorbleiche (5 %)	Thermo-Fisher	36-102-0599
Breite, nicht gezahnte Pinzette	Thermo-Fisher	09-753-50
Bromphenolblau	Sigma-Aldrich	114405-25G
Centramate-Kassettenhalter	PALL	CM018V
ChemiDoc XRS+	BioRad	1708265
Digitaler 1502 Sportsman Ei-Inkubator	Berry Hill	1502W
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125-500G
Ei-Kontrollleuchte (Egg Candler)	Berry Hill	A46
70 % Ethanol	Thermo-Fisher	BP82031GAL
Weibliche T-Stücke aus Nylon, 1/8 Zoll NPT(F)	Cole-Parmer	06349-50
Luftfeuchtigkeits-Kit	Berry Hill	3030
Iodixanol	Sigma-Aldrich	D1556	60 %ige (w/v) Lösung von Iodixanol in Wasser (steril)
L-Lysin-Monohydrochlorid	Sigma-Aldrich	62929-100G-F
Stutzen und Buchsen Luer-Lok, 1/8 Zoll Gewinde (NPT)	Cole-Parmer	41507-44
Masterflex L/S Digitalantrieb	Cole-Parmer	RK-07522-20	Peristaltikpumpe mit Digitalanzeige
Masterflex L/S Easy-Load-Pumpenkopf für Präzisionsschläuche	Cole-Parmer	RK-07514-10
Masterflex Silikonschlauch (Platin), L/S 16	Cole-Parmer	96420-16	BioPharm platinvernetztes Silikon
Omega-Membran LV Centramate-Kassette, 100K	PALL	OS100T02
Optima XE-90 Ultrazentrifuge	Beckman Coulter	A94471
PBS 10×-Lösung	Thermo-Fisher	BP399-20
Poly(Ethylen)glycol, durchschnittliches Mn 20.000	Sigma-Aldrich	81300-1KG
Slide-a-lyzer Dialysekassette (Extra stark), 10.000 MWCO, 0,5–3 mL	Thermo-Fisher	66380
Natriumhydroxid (Pellets)	Thermo-Fisher	S318-10
Eier frei von spezifischen Krankheitserregern	CFIA	NA	Der Lieferant variiert je nach Standort
Saccharose	Thermo-Fisher	S5-3
Supracap 50 Tiefenfilter	PALL	SC050V100P
Chirurgische Schere	Thermo-Fisher	08-951-5
Sw41Ti-Rotor	Beckman Coulter	331362	Verwendet in Protokollschritt 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7
SX4750-Rotor	Beckman Coulter	369702
SxX4750 Adapter für kegelförmige Röhrchen	Beckman Coulter	359472
Dünnwandige Ultraclear-Zentrifugenröhrchen (9/16 Zoll × 3 1/2 Zoll)	Beckman Coulter	344059
Schlauchschraubklemme	PALL	88216
Druckmessgeräte für den Allgebrauch	Cole-Parmer	68355-06