Sendai-Virus-vermittelte Reprogrammierung menschlicher Blutzellen in induzierte pluripotente Stammzellen

Zusammenfassung

Quelle: Rim, Y. A., et al. Generierung induzierter pluripotenter Stammzellen aus Blutzellen mittels Sendai-Virus und Zentrifugation. J. Vis. Exp. (2016).

Dieses Video zeigt die Erzeugung induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen mittels Sendai-Virus-vermittelter Reprogrammierung. Die viralen Transkriptionsfaktoren aktivieren Pluripotenznetzwerke und unterdrücken Linien-spezifische Gene, wodurch eine Teilmenge der Zellen Adhärenseigenschaften erlangt und iPSC-Kolonien bilden kann. Das Protokoll bereichert und erhält diese reprogrammierten Zellen durch selektive Matrixbindung und tägliche Erneuerung des Kulturmediums.

Protokoll

Alle Verfahren, die eine Probenentnahme beinhalten, wurden gemäß den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.

1. Transduktion mittels Sendai-Virus

1. Transduktion (Tag 0)
   1. Sammeln Sie die Blutzellen und überführen Sie sie in ein kegelförmiges 15-ml-Röhrchen und zählen Sie sie mithilfe eines Hämozytometers.
   2. Stellen Sie 3 x 10⁵ Zellen pro Transduktion bereit und zentrifugieren Sie die Zellen bei 515 x g für 5 min bei RT (Raumtemperatur).
   3. Entfernen Sie den Überstand durch Absaugen und resuspendieren Sie die Zellen in 0,5 ml Blutzellmedium.
   4. Überführen Sie die Zellen in eine Vertiefung einer nicht beschichteten 24-Loch-Platte.
   5. Tauen Sie die Sendai-Virus-Mischung auf Eis auf und geben Sie sie zu den suspendierten Zellen. Fügen Sie das Sendai-Virus den Zellen gemäß den Empfehlungen des Herstellers hinzu.
   6. Verschließen Sie die Platte mit einer Versiegelungsfolie und zentrifugieren Sie sie bei 1.150 x g für 30 min bei 30 °C.
   7. Incubieren Sie die Zellen nach der Zentrifugation über Nacht (O/N) bei 37 °C in 5 % CO₂.
2. Zelltransfer auf das Futterzell-Matrix (Tag 1)
   1. Am nächsten Tag beschichten Sie eine 24-Loch-Platte mit Vitronectin. Verdünnen Sie die Vitronectin-Lösung in PBS auf eine Endkonzentration von 5 µg/ml. Geben Sie 1 ml Vitronectin in eine Vertiefung einer 24-Loch-Platte und inkubieren Sie mindestens 1 Stunde bei RT. Entfernen Sie die Beschichtungslösung vor der Verwendung. Beschichtete Platten können bis zu 3 Tage bei RT gelagert werden.
   2. Überführen Sie das gesamte Medium mit den Zellen und dem Virus in die beschichtete Vertiefung.
   3. Sammeln Sie die verbleibenden Zellen mit zusätzlich 0,5 ml frischem Blutzellmedium auf und geben Sie sie zur Zellhaltigen Vertiefung hinzu.
   4. Zentrifugieren Sie die Platte bei 1.150 x g für 10 min bei 35 °C.
   5. Entfernen Sie nach der Zentrifugation den Überstand, geben Sie 1 ml iPSC-Medium hinzu und kultivieren Sie die Zellen über Nacht (O/N) bei 37 °C in 5 % CO₂.
3. Zweiter Zelltransfer (Tag 2)
   1. Beschichten Sie die Vertiefungen einer neuen 24-Loch-Platte mit 5 µg/ml Vitronectin, wie in Schritt 1.2.1 beschrieben. Verwenden Sie pro Transduktion eine Vertiefung der Platte.
   2. Überführen Sie die Zellsuspension von der ersten Platte auf die neu beschichtete Vitronectin-Platte.
      HINWEIS: Falls nicht benötigt, können die Suspensionzellen entsorgt werden. Das in Schritt 2.3 beschriebene Verfahren kann 2–3-mal mit den Suspensionzellen wiederholt werden. Falls die Schritte wiederholt werden, isolieren Sie die Zellen.
   3. Geben Sie in der Zwischenzeit 1 ml iPSC-Medium (induzierte pluripotente Stammzellen) zur Vertiefung der ersten Platte für die Erhaltungskultur hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C in 5 % CO₂ über Nacht (O/N).
   4. Kultivieren Sie die angehefteten Zellen bei 37 °C und 5 % CO₂ und wechseln Sie täglich das Medium mit frischem iPSC-Medium. Kolonien erscheinen 14–21 Tage nach der Transduktion.
   5. Zentrifugieren Sie die neu beschichtete Platte mit den Suspensionzellen bei 1.150 x g und 35 °C für 10 min.
   6. Incubieren Sie die Zellen nach der Zentrifugation bei 37 °C in 5 % CO₂ über Nacht (O/N).
   7. Am nächsten Tag entfernen Sie den Überstand und ersetzen ihn durch frisches iPSC-Medium.
      HINWEIS: Das in Schritt 1.3 beschriebene Verfahren kann 2–3-mal mit den Suspensionzellen wiederholt werden. Falls die Schritte wiederholt werden sollen, isolieren Sie die Zellen im Überstand und wiederholen Sie Schritt 1.3.
   8. Kultivieren Sie die angehefteten Zellen mit täglichen Mediumwechseln, bis eine Konfluenz von 80 % erreicht ist.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Kunststoffwaren
50-ml-Kunststoffrohr	SPL	50050
15-ml-Kunststoffrohr	SPL	50015
10-ml-Wegwerfpipette	Falcon	7551
5-ml-Wegwerfpipette	Falcon	7543
12-Loch-Platte	TPP	92012
24-Loch-Platte	TPP	92024
Materialien für die iPSC-Erzeugung und -Kultur
CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit	Life Technologies	A16518
TeSR-E8-Medien	STEMCELL Technologies	5940	iPSC-Medien
Vitronectin	Life Technologies	A14700
TrypLE express (TrypLE)	Life Technologies	12604-039
ReleSR	STEMCELL Technologies	12604-039	Lösung zum Ablösen von Kolonien