Analyse der Internalisierung des Influenza-Virus mittels eines Streptavidin-Blocking-Assays

Zusammenfassung

Quelle: Pohl, M. O. & Stertz, S. Messung der Bindung und Internalisierung von Influenza-A-Virus in A549-Zellen mittels Durchflusszytometrie. J. Vis. Exp. (2015)

In diesem Video wird die Anwendung eines Streptavidin-Blockierungsassays zur Unterscheidung zwischen auf der Oberfläche gebundenem und internalisiertem Influenza-Virus in menschlichen Lungenepithelzellen demonstriert. Der Vergleich der Fluoreszenzsignale zeigt, dass eine höhere Intensität nach der Inkubation auf eine erfolgreiche virale Internalisierung hinweist.

Protokoll

1. Bindungs-/Internalisierungs-Assay

HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Reagenzien vor Beginn des Assays vorbereitet sind. Für die drei Kontrollgruppen, die im Ergebnisteil dargestellt werden (mock-infizierte Zellen, mit Neuraminidase vorbehandelte Zellen und mit Natriumazid behandelte Zellen), sind geringfügige Anpassungen des Protokolls erforderlich.

1. Bereiten Sie 16 Tieflochtuben vor, die jeweils 200.000 A549-Zellen enthalten. Neben dem experimentellen Satz, der aus 4 Tuben besteht, gibt es 3 Kontrollbedingungen, von denen jede 4 Tuben erfordert: mock-infizierte Zellen, mit Neuraminidase (NA) vorbehandelte Zellen und mit Natriumazid behandelte Zellen. Jede Gruppe besteht aus 4 Tuben, die als „0 min“, „0 min + Streptavidin (STV)“, „30 min“ und „30 min + STV“ beschriftet sind.
2. Zentrifugieren Sie die Tuben 3 min bei 4 °C mit 450 × g. Entfernen Sie das Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 200 µl phosphatgepufferter Salzlösung (PBS).
3. Zentrifugieren Sie die Tuben bei 4 °C mit 450 × g. Entfernen Sie das Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 200 µl Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), das 0,3 % Rinderserumalbumin (BSA), 20 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) und 1 % Penicillin-Streptomycin enthält (Inkubationsmedium). Inkubieren Sie 30 min bei 37 °C.
   HINWEIS: Für die Neuraminidase-Kontrolle: Verwenden Sie bakterielle Neuraminidase (z. B. Sialidase aus Vibrio cholerae) in einer Konzentration von 200 mU/ml, verdünnt im Inkubationsmedium, um die Zellen zu resuspendieren.
4. Zentrifugieren Sie die Tuben 3 min bei 4 °C mit 450 × g. Entfernen Sie das Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 200 µl PBS. Wiederholen Sie diesen Schritt ein weiteres Mal und kühlen Sie die Tuben anschließend 10 min auf Eis ab.
5. Zentrifugieren Sie die Tuben 3 min bei 4 °C mit 450 × g. Entfernen Sie das Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 100 µl biotinyliertem Virus (verwenden Sie die in Abschnitt 2 bestimmte Virus-Konzentration, verdünnt in Infektions-PBS). Inkubieren Sie 1 h auf Eis.
6. Zentrifugieren Sie die Tuben 3 min bei 4 °C mit 450 × g. Entfernen Sie das Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 200 µl PBS. Wiederholen Sie diesen Schritt ein weiteres Mal.
   HINWEIS: Für die mock-infizierte Kontrolle: Verwenden Sie Infektions-PBS ohne Virus. Für die Natriumazid-Kontrolle: Verwenden Sie Virus, verdünnt in Infektions-PBS, ergänzt mit 0,1 % Natriumazid.
7. Verarbeitung der Proben nach der Infektion auf Eis:
   1. Verfahren Sie für die „0 min“-Proben gemäß Schritt 2,5 und lagern Sie die Proben bei 4 °C, bis die anderen Proben fixiert sind.
   2. Verfahren Sie für die „0 min + STV“-Proben: Zentrifugieren Sie die Tuben 3 min bei 4 °C mit 450 × g. Entfernen Sie das Überstand und resuspendieren Sie die Pellets in 50 µl STV (verwenden Sie die in Abschnitt 3 bestimmte Konzentration), verdünnt in PBS mit 2 % BSA und 0,1 % Natriumazid (um eine Internalisierung während der Probenaufarbeitung zu verhindern). Inkubieren Sie 30 min auf Eis.
   3. Zentrifugieren Sie die Tuben 3 min bei 4 °C mit 450 × g. Entfernen Sie das Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 200 µl PBS. Wiederholen Sie diesen Schritt ein weiteres Mal.
   4. Zur Fixierung zentrifugieren Sie die Tuben 3 min bei 4 °C mit 450 × g. Entfernen Sie das Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 100 µl 3,7 % Paraformaldehyd (PFA). Inkubieren Sie 10 min bei Raumtemperatur (RT). Wiederholen Sie dann den in 1.6 beschriebenen Waschschritt und lagern Sie die Proben bei 4 °C.
   5. Für die „30 min“-Proben: Zentrifugieren Sie die Tuben 3 min bei 4 °C mit 450 × g. Entfernen Sie das Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 200 µl PBS mit 2 % BSA. Inkubieren Sie 30 min bei 37 °C. Führen Sie die Schritte 1.7.3–1.7.4 durch und lagern Sie die Proben bei 4 °C.
      HINWEIS: Für die Natriumazid-Kontrolle: Verwenden Sie PBS, ergänzt mit 2 % BSA und 0,1 % Natriumazid, für die 30-minütige Inkubation bei 37 °C.
   6. Für die „30 min + STV“-Proben: Zentrifugieren Sie die Tuben 3 min bei 4 °C mit 450 × g. Entfernen Sie das Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 200 µl PBS mit 2 % BSA. Inkubieren Sie 30 min bei 37 °C. Zentrifugieren Sie dann die Tuben 3 min bei 4 °C mit 450 × g. Entfernen Sie das Überstand und resuspendieren Sie die Pellets in 50 µl STV (verwenden Sie die in Abschnitt 3 bestimmte Konzentration), verdünnt in PBS mit 2 % BSA und 0,1 % Natriumazid (um eine Internalisierung während der Probenaufarbeitung zu verhindern). Inkubieren Sie 30 min auf Eis. Führen Sie die Schritte 1.7.3–1.7.4 durch und lagern Sie die Proben bei 4 °C.
      HINWEIS: Für die Natriumazid-Kontrolle: Verwenden Sie PBS, ergänzt mit 2 % BSA und 0,1 % Natriumazid, für die 30-minütige Inkubation bei 37 °C.
8. Zur Permeabilisierung zentrifugieren Sie die Tuben 3 min bei 4 °C mit 450 × g. Entfernen Sie das Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 100 µl PBS mit 0,5 % Triton X-100. Inkubieren Sie 6 min bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie dann den in 1.6 beschriebenen Waschschritt.
9. Zentrifugieren Sie die Tuben 3 min bei 4 °C mit 450 × g. Entfernen Sie das Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 50 µl 2 % BSA, verdünnt in PBS, enthaltend STV-Cy3. (Beachten Sie, dass die geeignete Konzentration von STV-Cy3 vor Beginn des Experiments bestimmt werden sollte. Beginnen Sie mit einer Verdünnung von 1:200 und testen Sie Verdünnungen im Zweifachen bis zu 1:2.400. Nach unseren Erfahrungen erwies sich eine Verdünnung von 1:1.000 als optimal.)
10. Inkubieren Sie 1 h im Dunkeln bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie dann den in 1.6 beschriebenen Waschschritt, wobei das Pellet in 200 µl 2 % BSA, verdünnt in PBS, resuspendiert wird.
11. Analysieren Sie die Proben mittels Durchflusszytometrie. Bestimmen Sie den Prozentsatz der Cy3-positiven Zellen in jeder Probe.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DMEM	Life Technologies	41966-052
FBS	Life Technologies	10270-106
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15140-163
PBS	Life Technologies	14190-169
BSA	VWR Calbiochem	126579
HEPES	Life Technologies	15630-100
D-Sucrose	Fluka	84100
Bio Rad Protein Bio Assay	Bio Rad	500-0006
Tiefbrunnenplatten (1,2 ml Mikrogefäße)	Milian	82 00 001
PFA	Lucerna chem Electron microscopy sciences	15710
Ultrazentrifugenröhrchen	Hemotec HmbH	253070
Triton X-100	Fluka	93420
STV-Cy3	Life Technologies	43-4315
STV	Life Technologies	43-4302
Natriumazid	Fluka	71290
Bakterielle Neuraminidase/Sialidase	Sigma-Aldrich	N6514-1UN