Beurteilung der phagenvermittelten Hemmung des Bakterienwachstums mittels Messung der optischen Dichte

Zusammenfassung

Quelle: Niu, Y. D., et al. Wirksamkeit von Bakteriophagen zur biologischen Bekämpfung lebensmittelbedingter Krankheitserreger, bewertet mittels hochdurchsatzfähiger Methoden. J. Vis. Exp. (2021)

In diesem Video wird ein mikroplattenbasiertes Assay zur Beurteilung der lytischen Aktivität von Phagencocktails gegenüber E. coli-Bakterienkulturen demonstriert. Es zeigt auf, wie Änderungen der optischen Dichte die Wirksamkeit der Phagen und die zur vollständigen bakteriellen Hemmung erforderliche Konzentration offenbaren.

Protokoll

1. Vorbereitung von Puffer und Reagenzien

1. Stellen Sie 500 mL Trypcot-Soja-Brühe (TSB) (15 g TSB-Pulver und 500 mL ultrareines Wasser) her und autoklavieren Sie diese.
   HINWEIS: Diese kann bis zu 3 Monate bei Raumtemperatur oder bis zu 6 Monate bei 4 °C gelagert werden.
2. Stellen Sie 500 mL Trypcot-Soja-Agar (TSA) (20 g TSA-Pulver und 500 mL ultrareines Wasser) her und autoklavieren Sie diese.
   HINWEIS: Diese kann bis zu 3 Monate bei 4 °C gelagert werden.
3. Stellen Sie 500 mL Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS; 4 g NaCl, 0,1 g KCl, 0,77 g Na₂HPO₄ und 0,12 g KH₂PO₄, 500 mL ultrareines Wasser) her, messen Sie den pH-Wert und stellen Sie ihn auf 7,2 ± 0,2 bei 25 °C ein und autoklavieren Sie die Lösung.
   HINWEIS: Diese kann bis zu 6 Monate bei 4 °C gelagert werden.
4. Stellen Sie 200 mL 1 M MgSO₄ (49,294 g und 200 mL ultrareines Wasser) her und sterilisieren Sie die Lösung durch ein 0,22 µm Polyethersulfon-Filter.
5. Stellen Sie 500 mL TSB mit 10 mM MgSO₄ (mTSB; 15 g TSB-Pulver, 500 mL ultrareines Wasser und 5 mL 1 M MgSO₄) her und autoklavieren Sie diese; lassen Sie das autoklavierte Medium auf Raumtemperatur abkühlen. Arbeiten Sie aseptisch. Übertragen Sie vorsichtig 5,0 mL 1 M MgSO₄ mit einer serologischen Pipette und schwenken Sie vorsichtig zur Vermischung.

2. Vorbereitung der Bakterienkultur

1. Um die Bakterien-Forschungslabor-Kultur (BRLC) vorzubereiten, entnehmen Sie die Glycerin-Stammkulturen aus dem Gefrierschrank und bringen Sie sie ins Labor.
2. Verwenden Sie eine Einweg-Inokulationsnadel oder ein gleichwertiges Werkzeug, tauchen Sie sie in die Röhrchen, entnehmen Sie eine Spur der Inokulationsprobe (gefrorenes Suspension) und streichen Sie sie auf eine TSA-Platte oder ein gleichwertiges Medium innerhalb eines Biosicherheitswerks der Stufe II. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ± 2 °C für 15–18 h.
3. Verpacken Sie die vorbereiteten BRLC-Platten in Beutel und lagern Sie sie bei 4 °C.
   HINWEIS: Allgemeine Haltbarkeitsdauer der BRLC: 14 Tage bei 4 °C nach Anlage.
4. Inokulieren Sie eine einzelne Kolonie jeder E. coli-O157-Stammes von den BRLC-Platten, die getestet werden sollen, in 10 mL TSB und inkubieren Sie statisch bei 37 °C für 18 h, um 9 log10 KBE/mL zu erreichen.
5. Bereiten Sie am folgenden Morgen eine serielle Verdünnung der Übernachtkulturen jeder E. coli-O157-Stammes in mTSB, das 10 mM MgSO₄ enthält, vor, um 4–5 log10 KBE/mL (oder eine andere gewünschte Inokulationskonzentration) zu erreichen.
6. Mischen Sie gleiche Volumina der Übernachtkulturen jedes Stammes, um insgesamt 4–5 log10 KBE/mL (oder wie gewünscht) zu erreichen, und stellen Sie so die bakterielle Mischkultur her.
7. Stellen Sie die verdünnte Bakterienkultur unverzüglich bei 4 °C bereit, um sie später zu verwenden.
8. Verdünnen Sie die Inokulationskultur um den Faktor 10 oder 100 und pipettieren Sie jeweils 0,1 mL dieser Verdünnungen auf TSA-Platten, um isolierte Kolonien zu erhalten.

3. Herstellung der Phagen-Arbeitslösungen

1. Vermehren Sie Hochtitervorräte für jeden zu testenden Phagen (≥108 PFU/mL) gemäß den Standardmethoden4.
   HINWEIS: Die allgemeine Haltbarkeitsdauer der Phagenvorräte beträgt 3 Monate in einer Plastikflasche bei 4 °C nach der Herstellung.
2. Um die gewünschte Titerkonzentration, z. B. ~10⁸ PFU/mL, für die Lysiskinetik zu erreichen, verdünnen Sie die einzelnen Phagenvorbereitungen mit mTSB, das 10 mM MgSO₄ enthält. Stellen Sie Phagencocktails her, indem Sie gleiche Volumina jeder Arbeitssuspension mit dem gleichen Titer in allen möglichen Kombinationen mischen.

4. Vorbereitung der in-vitro-Lysiskinetik für einzelne Phagen und Phagencocktails

1. Bereiten Sie serielle 10-fache Verdünnungen jedes Phagen in den Spalten 1–8 in sterilen 96-Well-Mikroplatten vor, um den Mikroplatten-Assay einzurichten.
   HINWEIS: Vier Phagen gegen einen bakteriellen Stamm können in Duplikaten in benachbarten Spalten auf jeder Platte getestet werden. Die verbleibenden vier Spalten sind für Kontrollen vorgesehen, die ohne Phagen sowie mit dem mTSB-Blanko enthalten (Abbildung 1).
2. Füllen Sie 180 µL mTSB in die Wells der Spalten 1 bis 12 der 96-Well-Mikroplatte.
3. Geben Sie 20 µL verdünnte Einzelphagen oder Phagen-Cocktails (~108 PFU/mL) in die Wells 1–8 der obersten Reihe der Mikroplatte (Reihe A).
4. Für die phagenfreie Kontrolle und die Blanko-Kontrolle geben Sie jeweils 20 µL mTSB in das oberste Well der Spalten 9, 10 und 11.
5. Verdünnen Sie die Platte mit einer 12-Kanal-Pipette. Übertragen Sie 20 µL von Reihe zu Reihe. Mischen Sie den Inhalt durch wiederholtes vorsichtiges Ansaugen und Ausstoßen (mindestens fünfmal) gründlich und wechseln Sie die Spitzen zwischen den Verdünnungen. Entfernen Sie 20 µL aus der letzten Reihe (Reihe H).
   HINWEIS: Die Verwendung von Pipettenspitzen mit Filter wird empfohlen, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
6. Richten Sie ein Reservoir für jeden Stamm ein. Verwenden Sie eine 1-mL-Pipette, um 2–3 mL der verdünnten Kultur in das Reservoir zu überführen. Fügen Sie für die Spalten 1–10 mit einer Mehrkanalpipette jeweils 20 µL der verdünnten Bakterienkultur in jedes Well hinzu. Wechseln Sie die Spitzen nach jeder Zugabe.
7. Bedecken Sie die Mikroplatte und inkubieren Sie sie unter den gewünschten Bedingungen (z. B. 37 °C für 10 h oder 22 °C für 22 h).
8. Entnehmen Sie die Mikroplatten nach 2 h oder anderen gewünschten Zeitintervallen aus dem Inkubator.

Ergebnisse

Abbildung 1: Vorgeschlagene Anordnung des 96-Well-Mikroplatten-Assays. Serielle zehnfache Verdünnungen jedes Phagen werden in den Spalten 1–8 steriler 96-Well-Mikroplatten hergestellt. Auf jeder Platte können vier Phagen gegen einen bakteriellen Stamm in benachbarten Spalten dupliziert getestet werden. Die verbleibenden Spalten sind für Kontrollen vorgesehen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Unentbehrliche Hilfsmittel, Reagenzien und Geräte
Magnesiumsulfat-Heptahydrat	Sigma	1374361
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+	METTLER TOLEDO	17014382
Pipet-Lite LTS Pipette L-300XLS+	METTLER TOLEDO	17014405
Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+	METTLER TOLEDO	17013808
Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-20XLS+	METTLER TOLEDO	17014412
Pipettenspitzen RT LTS 1000µL FL 768A/8 – geringe Retention	METTLER TOLEDO	30389213
Pipettenspitzen SR LTS 20µL F 960A/5	METTLER TOLEDO	17005860
Reservoir	METTLER TOLEDO	89094-662
Sterile, klare, 96-Well-Platten aus Polystyrol mit flachem Boden und Deckeln	Fisher	168055
Tryptic-Soja-Agar (TSA)	Sigma	105458-0500
Tryptic-Soja-Brühe (TSB)	Sigma	105459-0500
T-förmige Zellverteiler	VWR	76299-566
Geräte
Kompakte mikrobiologische Inkubatoren	Fisher	50125590H
Polygon-Rührstäbchen	FIsher	14-512-125	Länge: 20 mm
Synergy Neo2 Hybrid-Multi-Mode-Lesegerät	Fisher	BTNEO2M
Software
SAS	SAS Institute	9.4