Markierung replizierender HSV-1-Genome mit einem Nukleosidanalogon

Zusammenfassung

Quelle: Dembowski, J. A., Deluca, N. A. Reinigung viraler DNA zur Identifizierung assoziierter viraler und zellulärer Proteine. J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video zeigt die Infektion von Mammalian-Zellen in der stationären Phase mit HSV-1 (Herpes Simplex Virus-1), gefolgt von der Replikation des viralen Genoms unter Verwendung der Wirt- und Virusreplikationsmaschinerie. Ein synthetisches Nukleosidanalogon wird in die neu synthetisierte virale DNA eingebaut, um replizierende Genome zu markieren, die anschließend für die proteomische Analyse assoziierter Wirt- und Virusproteine isoliert werden.

Protokoll

1. Zellkultur, virale Infektion und EdC (5-Ethinyl-2′-desoxycytidin)-Markierung (Abbildung 1)

Das folgende Protokoll beinhaltet die Arbeit mit Viren. Bitte beachten Sie die Biosicherheitsrichtlinien Ihrer Institution für den sicheren Umgang mit Viren und anderen biologischen Wirkstoffen. Dieses Protokoll wurde von der Institutional Review Board der University of Pittsburgh genehmigt.

1. Vernaschen Sie eine konfluente 150-cm²-Zellkulturflasche mit MRC-5-Zellen (Medical Research Council cell strain 5) und überführen Sie die Zellen in eine 600-cm²-Zellkulturplatte, die 100 mL DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) mit 10 % FBS enthält. Inkubieren Sie bei 37 °C in Gegenwart von 5 % CO₂ für 3–4 Tage, bis Konfluenz und die stationäre Phase erreicht sind. Eine konfluente 600-cm²-Platte enthält etwa 7 × 10⁷ Zellen. Bereiten Sie jeweils eine Platte pro Bedingung und eine Platte pro entsprechendem negativen Kontrollansatz vor.² Zellkulturkolben mit MRC-5-Zellen (Medical Research Council-Zelllinie 5) und Übertragung der Zellen in eine 600 cm² große Zellkulturschale, die 100 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) mit 10 % FBS enthält. Inkubation bei 37 °C in Gegenwart von 5 % CO₂₂ für 3–4 Tage, um Konfluenz und die stationäre Phase zu erreichen. Eine konfluente 600 cm²-Schale enthält ca. 7 × 10⁷ Zellen. Bereiten Sie 1 Platte für jede Bedingung und 1 Platte für jede entsprechende negative Kontrolle vor.
   HINWEIS: Die Zellen müssen die stationäre Phase erreichen, um die zelluläre DNA-Replikation zu hemmen, um sicherzustellen, dass in nachfolgenden Schritten ausschließlich vDNA (virale DNA) markiert und gereinigt wird.
   HINWEIS: Jede Probe erfordert eine entsprechende unmarkierte negative Kontrolle, die unter denselben Infektionsbedingungen und zum selben Zeitpunkt ohne Zugabe von EdC hergestellt wird.
   HINWEIS: Eine verkleinerte Version dieses Experiments sollte parallel durchgeführt werden, um mittels Bildgebung die Markierung der zellulären DNA unter vergleichbaren Bedingungen hinsichtlich Zellwachstum, Infektion, EdC-Markierung und Zeitpunkten zu überprüfen (siehe Schritt 2).
2. Verdünnen Sie 7 x 10⁸ PFU (Plaque-bildende Einheiten) HSV-1 in 7 mL kalter Tris-gepufferter Salzlösung (TBS). Entfernen Sie das Wachstumsmedium und lagern Sie es bei 37 °CZur Infektion das 7 mL verdünnte Virus zu den MRC-5-Zellen geben und 1 Stunde bei Raumtemperatur schwenken. Nach der Adsorption das Inokulum entfernen, mit 50 mL TBS bei Raumtemperatur spülen und das ursprüngliche Wachstumsmedium erneuern. Inkubieren bei 37 °C in Gegenwart von 5 % CO₂₂Dieser Schritt sollte für jede experimentelle Bedingung und jede entsprechende negative Kontrolle durchgeführt werden.
   HINWEIS: Eine stärkere EdC-Markierung kann durch Verwendung von HSV-1-Mutanten erreicht werden, die defekt in der Expression der viralen dUTPase (UL50-Gen) und/oder der Uracilglykosylase (UL2-Gen) sind. Die dUTPase von HSV-1 weist eine geringe Substratspezifität auf und kann die Aktivierung mehrerer Nukleosidanaloge vermindern.
3. Markieren Sie virale Genome mit EdC. Befolgen Sie die Anweisungen, um eintreffende Genome (1.3.1.), replizierende Genome (1.3.2.) oder virale Replikationsgabeln (1.3.3.) zu markieren.
   HINWEIS: Nur Schritt 1.3.1, 1.3.2 oder 1.3.3 sollte durchgeführt werden, je nachdem, ob in nachfolgenden Schritten eindringende Genome, replizierte Genome oder Replikationsgabeln analysiert werden sollen.
   HINWEIS: EdU oder f-ara EdU können anstelle von EdC verwendet werden. Die Toxizität von Nukleosidanalogen sollte überwacht und minimiert werden.
   1. Verwenden Sie vorab markierte Virenstämme, um die Infektion in Schritt 1.2 durchzuführen, und fahren Sie innerhalb von 4 Stunden nach der Infektion (hpi) mit Schritt 2 oder 3 fort, um nicht repliziertes vDNA zu untersuchen (Abbildung 1A).
      HINWEIS: Bereiten Sie vorab markierte Virusstämme mit dem zuvor beschriebenen Protokoll25 vor. Die Virusstämme müssen über eine G-25-Säule chromatographiert werden, um restliches EdC zu entfernen.
   2. Markieren Sie replizierende vDNA, indem Sie 5 - 25 µM EdC 2–4 h lang dem Zellkulturmedium infizierter Zellen hinzufügen (Abbildung 1BVor dem Hinzufügen EdC in 1 mL Wachstumsmedium verdünnen.
   3. Um virale Replikationsgabeln zu markieren, nach Beginn der vDNA-Replikation (≥4 hpi) die replizierende vDNA für 5–20 min mit 5–25 µM EdC puls markieren. Zum Verfolgen dreimal mit Chase-Medium, das 25–100 µM 2′-Desoxycytidin (DesoxC) enthält, spülen und anschließend weitere 20–40 min in Gegenwart des Chase-Mediums inkubieren (Abbildung 1C). 25 µM EdC für 5–20 min. Zum Chasen dreimal mit Chasemedium, das 25– 100 µM 2'-Desoxycytidin (deoxyC) und inkubieren Sie anschließend für weitere 20–40 min im Vorhandensein des Chase-Mediums (Abbildung 1C).
      HINWEIS: Puls- und Chase-Medium sollten auf 37 °C und 5 % CO₂₂ vor der Verwendung
      HINWEIS: Bei Puls-Chase-Experimenten ist es wichtig, die Zeitspanne zu berücksichtigen, die Nukleosiden benötigen, um in die Zelle einzudringen und phosphoryliert zu werden, bevor sie in die replizierende DNA eingebaut werden können. Dies muss empirisch bestimmt werden.
      HINWEIS: Um die Auflösung von Pulse-Chase-Experimenten zu bestimmen, berechnen Sie die virale Replikationsrate unter den verwendeten experimentellen Bedingungen. Dies kann durch quantitative PCR viraler Genome während eines einstufigen Wachstumszeitverlaufs ermittelt werden.

Ergebnisse

Abbildung 1: Ansätze zur Markierung von HSV-1-DNA. (A) Um den Zustand eindringender Viren zu analysieren, werden ruhende MRC-5-Zellen im G0-Stadium mit vorab markiertem HSV-1 infiziert, und die Genome werden vor weniger als 4 hpi untersucht, um nicht replizierende virale DNA zu erfassen. (B) Um den Zustand replizierter Viren zu analysieren, werden MRC-5-Zellen mit nicht markiertem HSV-1 infiziert, und EdC (orangefarbene Sterne) wird dem Wachstumsmedium der infizierten Zellen nach Beginn der viralen DNA-Replikation (≥4 hpi) für 2–4 h hinzugefügt und inkubiert. (C) Um virale Replikationsgabeln zu analysieren, werden infizierte Zellen für 5–20 min mit EdC gepulst. Anschließend können die Replikationsgabeln mit deoxyC verfolgt („chased“) werden. EdC-markierte DNA erscheint orange. Diese Abbildung wurde modifiziert nach Dembowski und DeLuca

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
MRC-5-Zellen	ATCC	CCL-171
Fetales Rinderserum (FBS)	Gibco	26140-179
Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium (DMEM)	Gibco	12800-082	Mit 10 % FBS, 2 mM L-Glutamin, 12 mM (für das Wachstum in Flaschen) oder 30 mM (für das Wachstum in Schalen) Natriumbicarbonat substituiert
600 cm² Zellkulturschale	Thermo Fisher Scientific	166508
Tris-gepufferte Salzlösung (TBS), pH 7,4			137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25,1 mM Tricin
HSV-1-Stamm			Stämme mit Titern über 1×10⁹ PFU/mL eignen sich am besten
5´-Ethinyl-2´-desoxycytidin (EdC)	Sigma-Aldrich	T511307	In DMSO lösen, um einen 40 mM-Stammlösung herzustellen, aliquotieren und bei -20 °C lagern
Zellkultur-Inkubator
Biosicherheitswerkbank
Heizblöcke			65 °C und 95 °C