Isolierung von Proteinen aus viralen DNA-Protein-Komplexen

Zusammenfassung

Quelle: Dembowski, J. A., et al. Aufreinigung viraler DNA zur Identifizierung assoziierter viral bedingter und zellulärer Proteine. J. Vis. Exp. (2017).

Dieses Video demonstriert die Isolierung von Protein–virale DNA-Komplexen aus Zellkernen mithilfe der Click-Chemie und der Reinigung mit magnetischen Bäden. Das Protokoll umfasst die Markierung viraler Genome mit alkinmodifizierten Nukleotiden, die Biotinylierung über eine Click-Reaktion und die Bindung an mit Streptavidin beschichtete magnetische Bäden. Nach Waschen und thermischer Elution werden die gereinigten Komplexe gesammelt, schockgefroren und für die anschließende Analyse aufbewahrt.

Protokoll

1. Reinigung von vDNA und assoziierten Proteinen

HINWEIS: Alle Puffer und Reagenzien sollten vor der Verwendung auf Eis abgekühlt werden, und alle Schritte müssen auf Eis durchgeführt werden, sofern nicht anders angegeben.

1. Isolierung der Kerne. HINWEIS: Vor der Isolierung der Kerne kann Formaldehyd zur Vernetzung von Proteinen mit DNA verwendet werden. Anschließend können strengere Waschbedingungen während der DNA-Reinigung an Streptavidin-beschichteten Kugeln angewendet werden.
   1. Ersetzen Sie das Wachstumsmedium durch 20 mL Kernextraktionspuffer (NEB) und inkubieren Sie 20 min bei 4 °C mit gelegentlichem Schwenken. Die Kerne werden im Mikroskop sichtbar.
   2. Lösen Sie die Kerne mit einem Zellabstreifer von der Platte ab, überführen Sie sie in ein 50-mL-Konizglas und zentrifugieren Sie 10 min bei 2.500 x g bei 4 °C, um die Kerne zu pelletieren. Entsorgen Sie den Überstand.
      HINWEIS: Trypanblaufärbung kann verwendet werden, um die Isolierung der Kerne aus Zellen zu überprüfen.
   3. Lösen Sie das Kernpellet vorsichtig in 10 mL phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf, überführen Sie es in ein 15-mL-Konizglas und pelletieren Sie es durch Zentrifugation 10 min bei 2.500 x g bei 4 °C. Entfernen Sie die PBS vollständig.
      HINWEIS: Die Kerne können eingefroren und das Protokoll an dieser Stelle unterbrochen werden. Dazu lösen Sie das Kernpellet vorsichtig in 500 µL Gefrierpuffer auf, inkubieren das Gefäß in einem Ethanol/Trockeneis-Bad und lagern die gefrorenen Kerne bei -80 °C. Vor der Verwendung tauen Sie die Kerne bei Raumtemperatur auf, überführen sie schnell auf Eis, geben 10 mL PBS hinzu, schwenken vorsichtig zur Vermischung, pelletieren durch Zentrifugation 10 min bei 2.500 x g bei 4 °C und entfernen die PBS vollständig. Das Einfrieren der Kerne kann zu einer verminderten Ausbeute führen.
2. Kovalente Konjugation von Biotin-Azid an 5-Ethynyl-2′-desoxycytidin (EdC)-markierte virale DNA oder vDNA.
   1. Lösen Sie das Kernpellet durch fünfmaliges vorsichtiges Auf- und Abpipettieren mit einer 10-mL-Pipette in 10 mL Click-Reaktionsgemisch [siehe Tabelle der Materialien] auf.
      HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Reagenzien des Click-Reaktionsgemischs in der angegebenen Reihenfolge hinzugefügt werden.
   2. Rühren Sie 1 h bei 4 °C. Währenddessen bereiten Sie Puffer B1, B2 und B3 vor und kühlen sie [siehe Tabelle der Materialien].
   3. Pelletieren Sie die Kerne durch Zentrifugation 10 min bei 2.500 x g bei 4 °C. Entfernen Sie vollständig das Click-Reaktionsgemisch und waschen Sie das Pellet, indem Sie es vorsichtig in 10 mL PBS resuspendieren und erneut 10 min bei 2.500 x g bei 4 °C zentrifugieren.
   4. Lösen Sie das Kernpellet vorsichtig in 1 mL PBS auf und überführen Sie es mit einer Pipettenspitze mit großem Durchmesser in ein 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen. Pelletieren Sie die Kerne durch Zentrifugation 10 min bei 2.500 x g bei 4 °C. Entfernen Sie die PBS vollständig und gefrieren Sie sofort in flüssigem Stickstoff ein.
      HINWEIS: Das Protokoll kann an dieser Stelle unterbrochen werden, und die gefrorenen Kerne können bei -80 °C gelagert werden. Ein Gefrier-Tau-Zyklus verbessert die anschließende Lyse, daher wird empfohlen, die Kerne einzufrieren, auch wenn direkt mit Schritt 1.3 am selben Tag fortgefahren wird.
3. Lysieren Sie die Kerne und fragmentieren Sie die DNA.
   1. Tauen Sie die Kerne auf Eis auf und resuspendieren Sie sie durch Auf- und Abpipettieren in 500 µL Puffer B1. Inkubieren Sie 45 min auf Eis.
   2. Sonifizieren Sie die Proben sechsmal je 30 s bei 40 % Amplitude mit einer 3-mm-Mikrotip-Sonde. Kühlen Sie die Proben zwischen den Impulsen jeweils 30 s auf Eis. Nach der Sonifizierung sollten die Proben klar und nicht trüb erscheinen.
      HINWEIS: Die Sonifizierungsbedingungen sollten für die jeweiligen Sonifikatoren optimiert werden.
   3. Pelletieren Sie Zelltrümmer durch Zentrifugation bei 14.000 x g für 10 min bei 4 °C. Die Pelletgröße sollte deutlich abnehmen. Filtern Sie den Überstand durch einen 100 µM-Zellfilter und sammeln Sie die Durchflussfraktion.
   4. Geben Sie 500 µL Puffer B2 zum filtrierten Überstand hinzu. 900 µL dieser Probe werden in Schritt 1.4.2 verwendet.
   5. Entnehmen Sie eine Aliquotprobe jeder Bedingung für die DNA-Isolierung (50 µL oder 1/20 des Volumens) und geben Sie 50 µL 2x Natriumlaurylsulfat (SDS)-Bicarbonatlösung hinzu [siehe Tabelle der Materialien]. Fahren Sie mit dem DNA-Isolierungsprotokoll fort.
   6. Entnehmen Sie eine Aliquotprobe jeder Bedingung für das Input-Protein (50 µL oder 1/20 des Volumens), geben Sie 50 µL 2x Laemmli-Probenpuffer hinzu, gefrieren Sie in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie bei -80 °C.
4. Bindung biotinylierter DNA an Streptavidin-beschichtete Kugeln.
   1. Bereiten Sie Streptavidin T1-Magnetkugeln vor, indem Sie 300 µL der Kugelsuspension in ein 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Bereiten Sie je eine Röhrchen pro Probe vor. Waschen Sie die Kugeln dreimal mit jeweils 1 mL Puffer B2, indem Sie durch Vortexen resuspendieren, ein Magnetfeld anlegen, um die Kugeln zu trennen, und den Waschpuffer abpipettieren.
      HINWEIS: Optimale Bindungsbedingungen führen zu maximaler Ausbeute und minimaler Hintergrundbindung. Experimentell wurde festgestellt, dass Streptavidin T1-Magnetkugeln eine signifikant höhere Bindungskapazität als Agarosekugeln sowie andere Streptavidin-Kugeln aufweisen und weniger Hintergrundbindung zeigen als Streptavidin C1-Kugeln (Abbildung 1A).
   2. Geben Sie 900 µL der Probe aus Schritt 1.3.4 zu den gewaschenen Kugeln und rühren Sie über Nacht bei 4 °C.
      Hinweis: Vortexen Sie die Kugeln nicht, nachdem die Probe hinzugefügt wurde.
      HINWEIS: Falls signifikante Mengen an DNA oder Protein in der unbehandelten Negativkontrolle isoliert werden, kann dieser Schritt von über Nacht auf 4 h verkürzt werden, um die Hintergrundbindung zu reduzieren.
5. Waschen Sie die Kugeln und eluieren Sie vDNA und assoziierte Proteine.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, für die verbleibenden Schritte Filterpipettenspitzen zu verwenden.
   1. Stellen Sie die Proben in einen magnetischen Mikrozentrifugenröhrchenhalter, entfernen Sie den Überstand, resuspendieren Sie vorsichtig in 1 mL Puffer B2 und rühren Sie 5 min bei 4 °C.
   2. Wiederholen Sie Schritt 1.5.1 dreimal.
   3. Stellen Sie die Proben in einen magnetischen Mikrozentrifugenröhrchenhalter, entfernen Sie den Überstand, resuspendieren Sie vorsichtig in 1 mL Puffer B3 und rühren Sie 5 min bei 4 °C.
   4. Überführen Sie 100 µL der Kugelsuspension (1/10 des Volumens) in ein neues Röhrchen zur Isolierung der gebundenen DNA. Legen Sie das Röhrchen auf den Magneten, entfernen Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Kugeln in 100 µL 1x Natriumlaurylsulfat- oder SDS-Bicarbonatlösung und fahren Sie mit dem DNA-Isolierungsprotokoll fort.
   5. Legen Sie das Röhrchen mit den verbleibenden 900 µL Kugelsuspension aus Schritt 1.5.3 auf den Magneten, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Kugeln in 50 µL 2x Laemmli-Probenpuffer, um Proteine und DNA-Protein-Komplexe zu eluieren.
   6. Erhitzen Sie die Proben 15 min bei 95 °C, vortexen Sie, zentrifugieren Sie kurz im Mikrozentrifugenröhrchen und legen Sie den Magneten an. Überführen Sie das Eluat in ein neues Röhrchen, gefrieren Sie sofort ein und lagern Sie bei -80 °C.
      HINWEIS: Verwenden Sie die Deckelverschlüsse, um sicherzustellen, dass die Röhrchen beim Erhitzen nicht aufspringen.
      HINWEIS: Das Protokoll kann an dieser Stelle unterbrochen werden, und die Proben können mehrere Wochen bei -80 °C gelagert werden.
   7. Analysieren Sie die Proteinproben durch Coomassie-Blau-Färbung, Western Blot oder Massenspektrometrie nach Standardverfahren. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 1 und 2 dargestellt.
      HINWEIS: Um zu bestimmen, ob die Proteinmenge für die Massenspektrometrie ausreicht, werden jeweils 7,5 µL jeder Probe für die Analyse mittels Coomassie-Blau-Färbung und 7,5 µL für den Western Blot eines repräsentativen, mit dem viralen Genom assoziierten Proteins (ICP4, ICP8 oder UL42) verwendet. Die gleiche Menge an Lysaten aus Schritt 1.3.6 wird parallel laufen gelassen, um die Input-Proteinmengen zu kontrollieren. Die verbleibende Probe (35 µL) wird anschließend mittels Massenspektrometrie analysiert.

Ergebnisse

Abbildung 1: Repräsentative Ergebnisse der Proteinreinigung. (A) Vergleich der Proteinausbeute bei der Durchführung der Reinigungsschritte unter Verwendung verschiedener Typen von mit Streptavidin beschichteten Kügelchen. Die Infektion wurde in Gegenwart von EdC (+) durchgeführt, um die Proteinausbeute zu vergleichen, oder in Abwesenheit von EdC (−), um die Hintergrundbindung zu vergleichen. Infektionen und die Markierung mit EdC wurden durchgeführt, und DNA-Protein-Komplexe wurden unter Verwendung vergleichbarer Mengen verschiedener Typen streptavidinbeschichteter Kügelchen gereinigt. Oberes Panel: Vergleich der Proteinmenge nach Reinigung an streptavidinbeschichteten Agarosekügelchen oder Streptavidin M-280. Unteres Panel: Vergleich der Proteinmenge nach Reinigung an Streptavidin M-270, M-280, Streptavidin C1 oder Streptavidin T1. Die Western-Blot-Analyse wurde mit einem Antikörper gegen das virale Protein ICP4 durchgeführt. Das gereinigte ICP4 ist in der ersten Bahn zum Vergleich dargestellt. Eine längere Belichtung des unteren Panels war erforderlich, um eine ähnliche Intensität von ICP4 in der Bahn zu beobachten "280" wie in der oberen Abbildung. (B) Repräsentative Ergebnisse der Proteinreinigung in Abhängigkeit von der Dauer der EdC-Markierung sind dargestellt. Infektionen und EdC-Markierungen wurden durchgeführt, und DNA-Protein-Komplexe wurden mittels Streptavidin-T1-Kügelchen gereinigt. Die EdC-Markierung erfolgte für 0, 20, 40 oder 60 min, und die Ergebnisse der Coomassie-Blau-Färbung (oben) sowie der Western-Blot-Analyse (unten) sind gezeigt. Die Western-Blot-Analyse wurde mit Antikörpern gegen ICP4, UL42 oder GAPDH durchgeführt. Die Eluatprobe stammt aus Schritt 1.5.5., die Lysatprobe aus Schritt 1.3.6. Der Pfeil markiert Streptavidin, während L die Proteinlängenskala angibt.

Abbildung 2: Beispiele für verschiedene Darstellungsmöglichkeiten von Proteomikdaten. (A) Kreisdiagramme fassen Proteine zusammen, die mittels Massenspektrometrie in Proteinfraktionen identifiziert wurden, die mit viralen Genomen assoziiert sind, die 6 Stunden nach der Infektion (hpi) gereinigt wurden. Die Werte geben die Anzahl der für jede Funktionskategorie identifizierten Proteine an. T steht für die Gesamtanzahl der identifizierten Proteine. Die Farben kennzeichnen folgende Kategorien: lila – RNA-Verarbeitung, rot – Transkription, grün – Chromatinremodeling, orange – DNA-Replikation, gelb – nukleare Transportprozesse, blaugrün – Cytoskelett, dunkelblau – HSV-Strukturproteine und grau – sonstige/Unbekannte. (B) Venn-Diagramme zeigen die Überschneidungen der Proteine, die mit viralen Genomen 6, 8 bzw. 12 Stunden nach der Infektion assoziiiert waren. (C) Eine STRING-Karte zeigt Proteine, die an viralen Replikationsgabeln nach einer 5-minütigen EdC-Pulsmarkierung angereichert wurden. Menschliche Proteine, die im Vergleich zur unmarkierten Negativkontrolle um das 5-Fache angereichert waren, sind in der funktionalen Interaktionskarte dargestellt, die mit STRING erstellt wurde, wobei nur Interaktionen mit hoher Zuverlässigkeit angezeigt werden. Zur Abbildung der Interaktionen wurden Genbezeichnungen verwendet. Kreise markieren Proteine, die in demselben biologischen Prozess funktionieren.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
MRC-5-Zellen	ATCC	CCL-171
Fetales Rinderserum (FBS)	Gibco	26140-179
Dulbecco’s modifiziertes Eagle-Medium (DMEM)	Gibco	12800-082	Ersetzt durch 10 % FBS, 2 mM L-Glutamin, 12 mM (für Wachstum in Kolben) oder 30 mM (für Wachstum in Schalen) Natriumbicarbonat
600 cm² Zellkulturschale	Thermo Fisher Scientific	166508
Tris-gepufferte Salzlösung (TBS), pH 7,4			137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25,1 mM Tricine
HSV-1-Stamm			Stämme mit Titern über 1×10⁹ PFU/mL eignen sich am besten
Sephadex-G-25-Säule (PD-10-Desalting-Säule)	GE Healthcare	17085101
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Fisher Scientific	D128-1
5´-Ethin-2´-desoxycytidin (EdC)	Sigma-Aldrich	T511307	In DMSO lösen, um 40 mM-Stammlösung herzustellen, portionieren und bei -20 °C lagern
2´-Desoxycytidin (DesoxyC)	Sigma-Aldrich	D3897	In Wasser lösen, um 40 mM-Stammlösung herzustellen, portionieren und bei -20 °C lagern
Kernextraktionspuffer (NEB)			Frisch herstellen (20 mM Hepes pH 7,2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl₂, 300 mM Saccharose, 0,5 % Igepal)
Zellkratzer	Bellco glass	7731-22000	Vor Gebrauch autoklavieren
Trypanblau-Lösung	Sigma-Aldrich	T8154
PBS, pH 7,2 (10x)			1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na₂HPO₄, 18 mM KH₂PO₄ (vor Gebrauch mit steriler Wasser auf 1x verdünnen)
Kupfer(II)-sulfat-Pentahydrat (CuSO₄·5H₂O)	Fisher Scientific	C489	100 mM-Stammlösung herstellen und bis zu 1 Monat bei 4 °C lagern
(+) Natrium-L-Ascorbat	Sigma-Aldrich	A4034	Frisch 100 mM-Stammlösung herstellen und bis zur Verwendung auf Eis lagern
Biotinazid	Invitrogen	B10184	10 mM-Stammlösung in DMSO herstellen, portionieren und bis zu 1 Jahr bei -20 °C lagern
Click-Reaktionsgemisch			Unmittelbar vor Gebrauch durch Zugabe der Reagenzien in der angegebenen Reihenfolge herstellen (10 mL: 8,8 mL 1x PBS, 200 µL 100 mM CuSO₄, 25 µL 10 mM Biotinazid, 1 mL 100 mM Natriumascorbat)
Vollständiger Proteaseinhibitorcocktail	Roche	11697498001	In 1 mL Wasser lösen, um 50x-Stammlösung herzustellen; kann bis zu 1 Woche bei 4 °C gelagert werden, oder direkt 1 Tablette zu 50 mL Puffer geben
Gefrierpuffer			Frisch herstellen (7 mL 100 % Glycerin, 3 mL NEB, 200 µL 50x Proteaseinhibitor)
Puffer B1			Frisch herstellen (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1 % Igepal, 1x Proteaseinhibitor)
Puffer B2			Frisch herstellen (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0,5 % Igepal, 1x Proteaseinhibitor)
Puffer B3			Frisch herstellen (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x Proteaseinhibitor)
Vibra Cell Ultraschallprozessor mit 3-mm-Mikrotip-Sonde	Sonics	VCX 130
Zellsieb	Falcon	352360
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	Life Technologies	65601
DynaMag-2-Magnet	Life Technologies	12321D
Mini-Röhrenrotator	Fisher Scientific	260750F
2x Laemmli-Probelösung			400 mg SDS, 2 mL 100 % Glycerin, 1,25 mL 1 M Tris (pH 6,8) und 10 mg Bromphenolblau in 8 mL Wasser mischen. Bis zu 6 Monate bei 4 °C lagern. Vor Gebrauch 1 M DTT auf eine Endkonzentration von 200 mM zugeben.
Deckelverschlüsse für 1,5-mL-Röhrchen	Fisher Scientific	NC9679153
Standard-Western-Blot-Reagenzien
NOVEX Colloidal Blue Färbekit	Invitrogen	LC6025
12-Loch-Zellkulturschale	Corning	3513
Deckgläser	Fisher Scientific	12-545-100	Vor Gebrauch autoklavieren
Mikroskopobjektträger	Fisher Scientific	12-552-5
16 % Paraformaldehyd	Electron Microscopy Sciences	15710	Vor Gebrauch in 1x PBS auf 3,7 % verdünnen
Rinderserumalbumin (BSA)	Fisher Scientific	BP1605	3 % in 1x PBS herstellen
Permeabilisierungspuffer (0,5 % Triton-X 100)	Sigma-Aldrich	T8787	0,5 % Triton-X 100 in 1x PBS herstellen
Click-Reaktionscocktail – Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit	Molecular Probes	C10337	Nach Herstellerprotokoll herstellen
2x SDS-Bicarbonatlösung			2 % SDS, 200 mM NaHCO₃
10x Tris-EDTA (TE), pH 8,0			100 mM Tris, 10 mM EDTA (vor Gebrauch auf 1x verdünnen)
Mikrozentrifuge für 1,5-mL-Röhrchen
Tischzentrifuge für 15- und 50-mL-Röhrchen
Zellkulturinkubator
Biosicherheitswerkbank
Heizblöcke			65 °C und 95 °C