Ein 3D-gedrucktes, silikonbeschichtetes Gerät zur Modellierung von katheterassoziierten Harnwegsinfektionen

Zusammenfassung

Quelle:
Ocean E. Clarke¹, Romy A. Dop¹, Tom Hasell¹, Joanne L. Fothergill¹, Daniel R. Neill<sup>2

1</sup>Universität Liverpool, ² Universität Dundee

Dieses Video zeigt die Verwendung eines 3D-gedruckten, silikonbeschichteten Geräts, das die Innenfläche von Harnkathetern nachahmt, um katheterassoziierte Harnwegsinfektionen zu simulieren.

Protokoll

Alle Verfahren zur Probenentnahme wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.

1. Additive Fertigung von Flexipeg-Modellen

1. Drucken Sie Stifte (24 Stifte pro Stiftdeckel erforderlich) und Stiftdeckel in hochtemperaturstabilem Harz mittels Stereolithographie (100 μm Schichthöhe).
   ANMERKUNG: Für die Stifte wird hochtemperaturstabiles Harz verwendet, und die Stiftdeckel können vor dem Experimentieren im Autoklaven sterilisiert werden.
2. Drucken Sie sowohl Formkomponenten als auch Teile des Reagenzglasgestells mit Hilfe von Fused Deposition Modeling (FDM) mit 60 % Füllung in 3D.
   ANMERKUNG: Jedes haltbare Harz ist für FDM geeignet, da Formen und Reagenzglasgestelle mit Ethanol sterilisiert werden können und keine Stabilität bei hohen Temperaturen erfordern.
3. Stellen Sie sicher, dass die Modellkomponenten korrekt gedruckt wurden, und entfernen Sie überschüssige Rückstände aus dem Druckprozess mit 70 % Ethanol.
4. Montieren Sie die Silikonmattenform wie in Abbildung 1 gezeigt und halten Sie die Seiten bei Bedarf mit Klebeband fest.

2. Vorbereitung des Flexipeg-Modells

1. Vorbereitung der Silikonmatte
   1. 18 g Silikonbasis (10:1 Base zum Katalysator Polydimethylsiloxan (PDMS), Kondensationshärtung) in ein Becherglas wiegen und 2 g Katalysator vorsichtig untermischen, bis alles gut vermischt ist.
      ANMERKUNG: Vermeiden Sie es, die Silikonmischung übermäßig zu bewegen, um zu verhindern, dass sich Blasen in der Form bilden.
   2. Gießen Sie die kombinierte Silikonmischung in die FDM-gedruckte Form und wischen Sie überschüssige Silikonmischung von den Seiten und der Oberseite der Form ab. Über Nacht (mindestens 18 Stunden) bei Raumtemperatur (RT) aushärten lassen.
   3. Entferne die Matte aus der Form und schneide überschüssiges Silikon von den Seiten ab. Stellen Sie sicher, dass die Matte in den Stiftdeckel passt, wie in Abbildung 1 gezeigt.
2. Beschichtung mit Stiften
   1. Stecken Sie die Heringe in eine Silikonmatte (24 Heringe pro Matte) und befestigen Sie die Matte mit Klebeband am Heringdeckel oder einer Kunststoffschale mit ähnlichen Abmessungen wie die Matte.
   2. Wiegen Sie 27 g Silikonbasis in eine flache Kunststoffschale (ungefähr die gleichen Abmessungen wie eine 96-Well-Platte) und mischen Sie 3 g Katalysator gründlich ein, bis alles gut vermischt ist.
   3. Drehen Sie die Stiftdeckel so um, dass die Stifte nach unten zeigen, und tauchen Sie die Stifte sofort in die Silikonmischung. Drehen Sie den Stiftdeckel um und lassen Sie das überschüssige Silikon an den Stiften heruntertropfen und die Stifte über Nacht bei Raumtemperatur aushärten.
      ANMERKUNG: Schnell aushärtendes Silikon (6-8 h vollständige Aushärtung; 40-60 min Arbeitszeit) tropft/fließt vor dem Aushärten weiter; Daher ist es nicht zwingend erforderlich, beim Tauchen den gesamten Stift mit PDMS zu beschichten, da jeder Überschuss den Rest des Stifts während des Aushärtens bedeckt.
   4. Wiederholen Sie nach der Aushärtung die Schritte 2.2.2 bis 2.2.3. bis die Stifte dreimal in PDMS beschichtet wurden. Stellen Sie sicher, dass die erste Beschichtungsschicht vollständig ausgehärtet ist, bevor Sie mit dem zweiten Beschichtungsschritt fortfahren.
      ANMERKUNG: Die endgültigen Wirbelbeschichtungen sollten <2 mm dick sein und keine sichtbaren Mängel aufweisen. Wenn Silikon nach der Inkubation über Nacht bei RT klebrig bleibt, lassen Sie es 24 Stunden lang aushärten und entsorgen Sie die Beschichtungen, wenn sich die Stifte noch klebrig anfühlen.
   5. Schneiden Sie mit einem sterilen Skalpell die Basis der silikonbeschichteten Stifte ab (so nah wie möglich an der Unterseite), um die Stifte aus der Beschichtungseinrichtung zu entfernen.
      ANMERKUNG: Dieser Vorgang sollte so lange wiederholt werden, bis die gewünschte Anzahl an Stiften und Silikonmatten vorbereitet ist. Überschüssiges PDMS, das im Peg-Beschichtungsprozess verwendet wird, kann verwendet werden, um neue Silikonmatten vor dem Aushärten zu gießen.
3. Aufbau des Modells
   1. Setzen Sie beschichtete Heringe in die Silikonmatte ein und befestigen Sie die Matte im Stiftdeckel, wie in Abbildung 1 gezeigt.
   2. Decken Sie die Unterseite des Heringsdeckels/der Silikonmatte (die an der Heringbasis befestigt ist) mit autoklavierbarem Klebeband ab, um die Heringe an Ort und Stelle zu halten. Legen Sie den Stiftdeckel in einen versiegelten autoklavierbaren Beutel und sterilisieren Sie ihn vor dem Gebrauch.
      ANMERKUNG: Die Stifte im Stiftdeckel passen in eine 96-Well-Platte in einer einzigen Ausrichtung. Überprüfen Sie nach dem Abkleben der Stifteinrichtung die Ausrichtung der Stifte in einer 96-Well-Ersatzplatte und beschriften Sie das Autoklavenband entsprechend mit der richtigen Deckelausrichtung.

3. Beimpfung der Modelle

1. Vorbereitung der Bakterienkultur
   1. Bereiten Sie über Nacht Kulturen mit im Test befindlichen Bakterienisolaten vor, indem Sie eine Schlaufe voller Bakterienkolonien, die auf festen Medien gezüchtet wurden, in 10 ml Luria-Bertani (LB) Brühe suspendieren. Über Nacht (18 h) bei 37 °C unter Rühren inkubieren.
      ANMERKUNG: Für die Verwendung im Flexipeg-Biofilmmodell werden mindestens drei biologische Replikate empfohlen.
   2. Normalisieren Sie die Kulturen auf einen OD_{600 nm}von 0,1 (ca. 10⁸ koloniebildende Einheiten (KBE)/ml nach Plattenverdünnung) in einem Endvolumen von 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
2. Mikrotiterplatten-Setup und Inokulation
   1. Aliquotieren Sie 135 μl gepoolten menschlichen Urin (PHU) in jeder Testvertiefung in einer 96-Well-Platte gemäß dem Plattenlayout in Abbildung 1 (8). Jedes Well repräsentiert ein technisches Replikat (pro biologischem Replikat sind mindestens n = 3 technische Replikate erforderlich).
      ANMERKUNG: Künstliche Urinmedien (AUM) können anstelle von PHU verwendet werden, wenn dies vom Benutzer gewünscht wird.
   2. Beimpfen Sie jede Vertiefung im Test mit 15 μl der normalisierten Übernachtkultur, was zu einem endgültigen Well-Volumen von 150 μl führt. Reservieren Sie mindestens 100 μl der normalisierten Übernachtkultur für serielle Verdünnungen, um die KBE/ml des Inokulums zu validieren.
   3. Bereiten Sie Negativkontrollen vor, indem Sie 150 μl steriles PHU nur in die entsprechenden Vertiefungen aliquotieren.
   4. Setzen Sie nach dem Einrichten der Mikroplatte die Stifte in die jeweiligen Vertiefungen ein (wie vor der Autoklavsterilisation der Stifte bestimmt) und stellen Sie sicher, dass der Stiftdeckel bündig mit der Oberfläche der Platte abschließt. Decken Sie den Stiftdeckel mit dem Mikrotiterplattendeckel ab und halten Sie ihn bei Bedarf mit Autoklavenband fest.
   5. Legen Sie die Stiftmodelle in eine versiegelte Plastikwanne/einen versiegelten Plastikbeutel mit einer feuchten blauen Rolle, um eine Verdunstung zu verhindern, und inkubieren Sie sie 24 Stunden lang statisch bei 37 °C.
3. Validierung des Inokulums
   1. Aliquotieren Sie 180 μl PBS in die Reihen 2-6 der ersten Spalte einer 96-Well-Mikroplatte und geben Sie die reservierten 100 μl normalisierte Übernachtkultur in die erste Vertiefung.
   2. Entnehmen Sie 20 μl der normalisierten Übernachtkultur aus der ersten Vertiefung und aliquotieren Sie sie in die zweite Vertiefung, wobei Sie zum Mischen vorsichtig auf und ab pipettieren.
   3. Schritt 3.3.2 wiederholen, bis das ursprüngliche Inokulum bis zur letzten Vertiefung verdünnt wurde (1 × 10⁵).
   4. 10 μl Flecken jeder Verdünnung in dreifacher Ausfertigung auf geeignete feste Medien auffüllen. Über Nacht bei 37 °C statisch inkubieren.
   5. Zählen Sie nach der Inkubation die Anzahl der Kolonien an jeder Stelle, um die tatsächliche KBE/ml des Inokulums zu berechnen.

4. Quantifizierung von Biofilmen

1. Verarbeitung von Zuordnungen
   1. Entfernen Sie nach der Inkubation das Stiftmodell von der Mikroplatte und drehen Sie es unter einer Flamme oder in einem mikrobiellen Sicherheitsschrank um (Stifte zeigen nach oben). Mikrotiterplatten verwerfen.
   2. Übertragen Sie den Peg-Deckel auf eine frische Mikroplatte mit 180 μl Aliquoten sterilem PBS, um nicht anhaftende Zellen zu entfernen. Wiederholen Sie dies zweimal in frischem PBS für insgesamt drei Waschschritte.
      ANMERKUNG: Um eine Beschädigung der oberflächenassoziierten Biofilme zu vermeiden, vermeiden Sie es, die Stifte zu stören, wenn Sie den Stiftdeckel von jeder Mikroplatte entfernen (d. h. die Well-Ränder berühren).
2. KBE/ml-Enumeration (Biofilm-assoziiert)
   1. Arbeiten Sie aseptisch unter einer Flamme oder in einer mikrobiologischen Sicherheitswerkbank, stellen Sie das Röhrchengestell (hergestellt in Schritt 1.2.) mit sterilen Glasreagenzgläsern auf, wie in Abbildung 1 gezeigt, und befestigen Sie die Rack-Oberseite, die auf den Stiftdeckel passt.
   2. Aseptisch aliquotieren Sie 600 μl steriles PBS in jedes Reagenzglas.
   3. Setzen Sie den Stiftdeckel in das Gestell ein, wobei die Stifte in einer Linie mit den Röhrchen im Gestell liegen. Entfernen Sie das Autoklavenband am Deckel des Stifts.
   4. Schieben Sie die Stifte mit einer sterilen Pinzette durch den Stiftdeckel und in die entsprechenden Reagenzgläser, die darunter ausgerichtet sind.
   5. Setzen Sie die Röhrchendeckel wieder auf und wirbeln Sie jedes Röhrchen 60 s lang, um die Biofilm-assoziierten Zellen von der Stiftoberfläche zu disaggregieren.
   6. Entfernen Sie 100 μl aus jedem Röhrchen und verdünnen Sie es seriell, wie zuvor in Schritt 3.3 in sterilem PBS beschrieben.
   7. Mit einer serologischen Pipettenplatte 10 μl jeder Verdünnung auf geeignete feste Medien aufsprühen und über Nacht statisch bei 37 °C inkubieren.
   8. Zählen Sie nach der Inkubation die Anzahl der Kolonien auf jeder Verdünnungsplatte und verwenden Sie sie, um die KBE/ml zu berechnen.
3. Kristallviolette Färbung
   1. Aliquotieren Sie 180 μl 0,1 % (w/v) Kristallviolett (in sterilem Wasser) in die 24 Testvertiefungen einer 96-Well-Mikrotiterplatte.
   2. Setzen Sie das gespülte Stiftmodell (Stifte und Stiftdeckel) in die entsprechenden Vertiefungen der Mikroplatte ein. 20 min statisch bei Raumtemperatur inkubieren.
   3. Entfernen Sie nach der Inkubation das Peg-Modell von der Mikroplatte und entsorgen Sie die Mikrotiterplatte.
   4. Spülen Sie den gesamten Hering in einer entsprechend großen Wanne unter leichtem Rühren mit Leitungswasser ab. Wiederholen Sie dies dreimal.
   5. Drehen Sie das Hering-Modell um und lassen Sie die Pegs bei RT vollständig trocknen.
   6. Aliquotieren Sie 180 μl 30%ige Essigsäure in eine frische 96-Well-Mikroplatte und setzen Sie das getrocknete Peg-Modell in die entsprechenden Wells ein. 30 Minuten bei RT inkubieren.
   7. Entfernen Sie das Peg-Modell von der Mikroplatte und lesen Sie den OD_{540 nm} der gefärbten Vertiefungen mit einem Mikroplatten-Reader oder Spektralphotometer ab.
   8. Zur Berechnung der Biofilmbildung auf Pegs wird der OD_{540 nm} der gefärbten Negativkontrollpegs gemittelt und vom Durchschnitt der Testpegs subtrahiert.

Ergebnisse

Abbildung 1: Eine schematische Darstellung des Flexipeg-Modellaufbaus. (1) Ein einzelnes Flexipeg, beschichtet mit Polydimethylsiloxan (PDMS), um die Oberfläche des Harnkatheters für die Biofilmbildung zu replizieren. (2) Die Flexipeg-Biofil...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
96-Well-Mikrotiterplatten	Greiner	650161	U-förmiger/runder Boden.
Essigsäure	SLS	695092-2.5LSIG	≥ 99,7 % ACS-Reagenz.
Kristallviolett	Merck	Artikel-Nr.: 61135-25G
Individueller Stift	Betriebseigen	Flexipeg-Komponenten, die in 3D gedruckt werden sollen	Additive Fertigung mit hochtemperaturstabilem Harz (24 Stifte pro Flexipeg-Modell erforderlich). Hergestellt aus Formlabs Hochtemperaturharz von Protolabs (NL).
Luria-Bertani (LB) Brühe	Neogen	NCM0088B	LB-Brühe (Miller).
Deckel, der auf eine 96-Well-Platte passt	Betriebseigen	Flexipeg-Komponenten, die in 3D gedruckt werden sollen	Additive Fertigung unter Verwendung von hochtemperaturstabilem Harz.
Form zur Herstellung der Silikonmatte	Betriebseigen	Flexipeg-Komponenten, die in 3D gedruckt werden sollen	Additive Fertigung aus jedem haltbaren Material. Hergestellt aus ABS-Prototyping-Harz von Protolabs (NL).
Form zur Vorbereitung der Silikonmattenseite	Betriebseigen	Flexipeg-Komponenten, die in 3D gedruckt werden sollen	Additive Fertigung aus jedem haltbaren Material.
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Merck	P4417-50TAB
Gepoolter menschlicher Urin	-	-	Gesammelt von gesunden Spendern nach ethischer Genehmigung durch die zentrale Ethikkommission der Universitätsforschung.
Gestell für Glasröhren	Betriebseigen	Flexipeg-Komponenten, die in 3D gedruckt werden sollen	Additive Fertigung aus jedem haltbaren Material.
Silikon (PDMS)	MB Fiberglas	GP3481-F	Polycraft Allzweck RTV Kondensationshärtung Formenbau Silikonkautschuk.
Oberseite, die auf den Heringdeckel passt	Betriebseigen	Flexipeg-Komponenten, die in 3D gedruckt werden sollen	Additive Fertigung unter Verwendung von hochtemperaturstabilem Harz.
Foley-Katheter	Großer Bär Healthcare UK Ltd		14 Kanäle, 100% Silikon