Cäsiumchlorid-basierte Reinigung von genomhaltigen adenoviralen Vektoren

Zusammenfassung

Quelle: Ehrke-Schulz, E., et al. Klonierung und großtechnische Herstellung von Hochkapazitäts-Adenovirusvektoren basierend auf dem menschlichen Adenovirus Typ 5. J. Vis. Exp. (2016)

In diesem Video wird die Reinigung von Hochkapazitäts-Adenovirusvektoren mittels Cäsiumchlorid-Gradienten-Ultrazentrifugation demonstriert, die die Trennung von genomhaltigen Viruspartikeln für Anwendungen in der Genübertragung, Charakterisierung von Vektoren und präklinischen therapeutischen Studien ermöglicht.

Protokoll

1. Reinigung und Dialyse von HCAdV (Vektoren mit hoher Kapazität auf Basis adenoviraler Viren)
   1. Um das virale Lysat für Cäsiumchlorid-(CsCl-)Gradienten vorzubereiten, frieren Sie die Zell-Virus-Suspension viermal in flüssigem Stickstoff ein und tauen sie jeweils in einem Wasserbad bei 37 °C auf.
   2. Zentrifugieren Sie das virale Lysat 8 Minuten bei Raumtemperatur (RT) mit 500 × g und sammeln Sie den Überstand, der die HCAdV (Vektoren mit hoher Kapazität auf Basis adenoviraler Viren) enthält.
   3. Für die Ultrazentrifugation bereiten Sie CsCl-Lösungen wie folgt vor: Wiegen Sie jeweils 37,5 g (für 1,5 g/cm³), 33,5 g (für 1,35 g/cm³) und 31,25 g (für 1,25 g/cm³) CsCl-Pulver ab und füllen Sie mit dH₂O auf 25 ml auf.
      1. Rühren Sie, bis die Lösung klar ist, und filtrieren Sie die Lösungen steril. Entnehmen Sie abschließend jeweils 1 ml jeder Lösung und wiegen Sie es auf einer Feinwaage ab, um zu prüfen, ob die Dichte korrekt ist. 1 ml sollte jeweils 1,5 g, 1,35 g bzw. 1,25 g wiegen.
      2. Falls die Dichte zu hoch ist, stellen Sie sie durch schrittweises Hinzufügen kleiner Volumina (µl) sterilen dH₂O ein. Nach Zugabe von dH₂O messen Sie die Dichte erneut. Falls nötig, geben Sie weiteres dH₂O hinzu.
      3. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die Dichte korrekt ist. Falls die Dichte zu niedrig ist, stellen Sie sie durch Zugabe einer geringen Menge CsCl-Pulver ein. Filtern Sie erneut steril und prüfen Sie die Dichte. Falls die Dichte weiterhin zu hoch ist, stellen Sie sie durch Zugabe von dH₂O wie zuvor beschrieben ein. Falls die Dichte immer noch zu niedrig ist, geben Sie mehr CsCl hinzu, filtern erneut steril und prüfen die Dichte. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die Dichte korrekt ist.
   4. Stellen Sie CsCl-Stufengradienten in 6 klaren Ultrazentrifugenröhrchen her. Pipettieren Sie die CsCl-Lösungen vorsichtig und langsam in die Röhrchen in folgender Reihenfolge: 0,5 ml der 1,5 g/cm³-CsCl-Lösung, 3 ml der 1,35 g/cm³-CsCl-Lösung und 3,5 ml der 1,25 g/cm³-CsCl-Lösung (Abbildung 1C).
   5. Überlagern Sie etwa 4,5 ml des geklärten Vektor-Überstands aus Schritt 1.2 auf der 1,25 g/cm³-CsCl-Schicht. Zentrifugieren Sie die Gradienten in einer Ultrazentrifuge mit Schwingrotor (SW-41) bei 12 °C mindestens 2 Stunden bei 226.000 × g (35.000 U/min) mit langsamer Beschleunigung und Verzögerung, um virale Partikel, die HCAdV-Genom enthalten, von leeren Partikeln und Zelltrümmern zu trennen.
      HINWEIS: Unter optimalen Bedingungen bildet sich eine diffuse Bande aus Zelltrümmern an der Oberseite der Röhrchen. Darunter sind zwei weiße Banden sichtbar. Die obere Bande enthält leere Partikel, während die untere Bande dem HCAdV entspricht (Abbildungen 1C und 2A).
   6. Entfernen Sie vorsichtig die Schichten aus Zelltrümmern und leeren Partikeln und sammeln Sie jeweils 1 ml der unteren Bande aus jedem Röhrchen. Überführen Sie das Virus mit einer sauberen Pipettenspitze in ein steriles 50-ml-Röhrchen. Füllen Sie bis zu 24 ml der 1,35 g/cm³-CsCl-Lösung zu den gesammelten Viruspartikeln hinzu und mischen Sie vorsichtig.
   7. Füllen Sie die Zentrifugenröhrchen mit der 1,35 g/cm³ -CsCl-Viruslösung bis zum Rand und zentrifugieren Sie über Nacht (O/N) (18–20 h) bei 226.000 × g (35.000 U/min) bei 12 °C in einer Ultrazentrifuge mit Schwingrotor (SW-41) mit langsamer Beschleunigung und Verzögerung.
   8. Sammeln Sie das in der deutlich sichtbaren unteren Bande vorhandene HCAdV. Da eine mögliche obere Bande leere Partikel enthält, entfernen Sie die oberen Schichten von oben mit einer Pipette (siehe Abbildungen 1C und 2B). Entnehmen Sie anschließend die untere Bande mit einer Pipette.
   9. Dialysieren Sie die gesammelten Viruspartikel zur Pufferaustauschung.
      1. Schneiden Sie ein etwa 8 cm langes Stück Dialysefolie (MWCO: 50.000) ab, waschen Sie es dreimal mit sterilen dH₂O. Verschließen Sie dann ein Ende der Dialysefolie mit einer Plastikklammer und überführen Sie das aus Schritt 5.8 gesammelte Virus mit einer 1-ml-Pipette in die Folie. Vermeiden Sie Luftblasen in der Folie und verschließen Sie das andere Ende mit einer Plastikklammer für die Dialyse.
      2. Dialysieren Sie 2 Stunden bei 4 °C in 1 L Dialysepuffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 % Glycerin und 1 mM MgCl₂ (Magnesiumchlorid) in entionisiertem H₂O) unter langsamer Rührung. Ersetzen Sie den Dialysepuffer durch 2 L frischen Dialysepuffer und dialysieren Sie über Nacht bei 4 °C unter langsamer Rührung. Alternativ kann ein Saccharosepuffer verwendet werden (140 mM NaCl (Natriumchlorid), 5 mM Na₂HPO₄·2H₂O (Dinatriumhydrogenphosphat), 1,5 mM KH₂PO₄ (Kaliumdihydrogenphosphat) und 730 mM Saccharose, pH 7,8).
      3. Sammeln Sie die dialysierten Viruspartikel aus Schritt 1.9.2. mit einer 1-ml-Pipette. Bereiten Sie mehrere Aliquots in gewünschten kleinen Volumina (25–100 µl) vor und lagern Sie das gereinigte Virus bei -80 °C.

Ergebnisse

Abbildung 1. Repräsentative Ergebnisse für das Klonierungsverfahren und die Freisetzung des HCAdV-Genoms (Vektoren mit hoher Kapazität auf Adenovirusbasis) aus pAdVFTC. (A) Freisetzung der Gen-des-Interesses-Expressionskassette (GOI) aus pHM5 durch Verdau mit PI-SceI und I-CeuI. (B) Gereinigte GOI-Expressionskassette und gereinigtes, dephosphoryliertes pAdVFTC, jeweils mit PI-SceI und I-CeuI verdaut. (C) Analytischer HincII-Verdau von pAdVFTC-Klonen mit und ohne GOI. (D) Freisetzung des HCAdV-Genoms, das die GOI trägt, aus pAdVFTC-GOI durch Verdau mit NotI

Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse nach Cäsiumchlorid (CsCl)-Dichtegradientenzentrifugation. (A) Nach Durchführung einer Sprunggradientenzentrifugation (siehe auch Schritt 1,5); (B) Nach kontinuierlicher Gradientenzentrifugation (siehe auch Schritt 1,7).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ultra Clear Ultrazentrifugenröhrchen	Beckmann Coulter	344059	Dichtegradientenzentrifugation
Ultrazentrifuge	Beckmann Coulter		Dichtegradientenzentrifugation
SW-41-Rotor	Beckmann Coulter		Dichtegradientenzentrifugation
Spectrum Laboratories Spectrapor-Membran	VWR	132129	Dialyse-Schlauch
Fertige Dialysekassetten	Thermo	66383	Dialyse
Cäsiumchlorid	Carl Roth	8627.1	Dichtegradientenzentrifugation
LB-Medium	Carl Roth	X968.3	Bakterienwachstumsmedium
Tris-HCl 99 %	Carl Roth	9090.3	Dialysepuffer/Lysepuffer
Glycerin 99,5 %	Carl Roth	3783.1	Dialysepuffer
MgCl₂ 98,5 %	Carl Roth	KK36.2	Dialysepuffer
NaCl	Carl Roth	3957.1	optionaler Dialysepuffer
KH₂PO₄	Carl Roth	3904.2	optionaler Dialysepuffer
Saccharose	Carl Roth	9286.1	optionaler Dialysepuffer
Na₂HPO₄·2H₂O	Carl Roth	4984.2	optionaler Dialysepuffer
1,5-ml-Röhrchen	sarstedt	72,730,005	Lagerung von Viruspräparationen bei -80 °C