Virale Gentransfektion im Mausherzen zur Bewertung von Geneffekten auf die Herzfunktion

Zusammenfassung

Quelle: Lu, A., et al. Virale Transgenexpression in Nagetierherzen und Bewertung des kardialen Arrhythmierisikos. J. Vis. Exp. (2022)

Das Video zeigt eine Methode zur Ultraschall-gestützten intramyokardialen Injektion eines rekombinanten viralen Vektors in einem Mausmodell. Diese Technik ermöglicht eine gezielte Gendelivery an das Herz, um die Auswirkungen der Transgenexpression auf die Herzfunktion zu untersuchen.

Protokoll

1. Virale Transgenexpression in ventrikulären Geweben von Nagetieren

HINWEIS: Lagern Sie rekombinantes Adenovirus oder adeno-assoziiertes Virus (AAV), das das Zielgen exprimiert, sowie das entsprechende Kontrollvirus, beispielsweise Ad-GFP (Grünes fluoreszierendes Protein) (Titer von 1 × 10¹⁰ Plaque-bildenden Einheiten [PFU]/mL) oder AAV9-GFP (Titer von 1 × 10¹³ Genomkopien [GC]/mL) (siehe Tabelle der Materialien), in einem −80 °C-Gefrierschrank.

1. Am Tag der Virusinjektion den Virus auf Eis auftauen. Den Virus, der das Zielgen exprimiert, sowie den Kontrollvirus in zwei separate Spritzen (Volumen = 50 µL) mit 30-G-½-Nadeln aufziehen und bis zur Verwendung auf Eis lagern.
   HINWEIS: Eventuelle Blasen in der Spritze und Nadel müssen sorgfältig entfernt werden.
2. Buprenorphin an Ratten oder Mäuse verabreichen (0,05 mg/kg für Ratten, 0,1 mg/kg für Mäuse, subkutan), eine Stunde später die Anästhesie mit 3 % Isofluran einleiten und für das anschließende Verfahren 2 % Isofluran beibehalten (in 100 % Sauerstoff bei einer Flussrate von 0,5–1,0 L/min).
3. Den Körper des Tieres vorsichtig mit einer Pinzette (z. B. am Schwanz) einklemmen; wenn das Tier nicht mit Körperbewegungen auf den Reiz reagiert, ist die ausreichende Anästhesie bestätigt.
4. Die Körpertemperatur mit einer elektrischen Heizplatte bei 37 °C halten. Das Fell im Brustbereich mit einem Haarschneider rasieren.
   HINWEIS: Bei Verwendung einer elektrischen Heizplatte ist Vorsicht geboten, da eine ungleichmäßige Wärmeverteilung auftreten kann.
5. Ophthalmische Salbe auf beide Augen auftragen, um das Austrocknen der Hornhaut zu verhindern.
6. Das Tier in Rückenlage halten und ein präklinisches Bildgebungssystem (siehe Tabelle der Materialien) zur Ultraschallbildgebung des Herzens des Tieres in kurzer Achse verwenden.
   HINWEIS: Die folgenden Schritte werden in einem Biosicherheitswerkbank der Stufe II durchgeführt, die eine sterile Umgebung bietet. Es werden Standard-Sicherheitsverfahren angewendet, einschließlich sicherem Umgang mit Nadeln.
7. Den linken unteren Brustbereich des Tieres durch dreimaliges kreisförmiges Wechseln zwischen einer jod- oder chlorhexidinbasierten Desinfektionslösung und Alkohol desinfizieren.
8. Unter Ultraschallbildgebungsführung die 30-G-1/2-Nadel der in Schritt 1.1 vorbereiteten Spritze über die linke untere Brustseite des Körpers in die Brust des Tieres einführen.
9. Die Nadelspitze an die vordere freie Wand des linken Ventrikels heranführen und langsam 10–15 μL des Virus injizieren. Den erfolgreichen Injektionsvorgang anhand der erhöhten Helligkeit in der Nähe der Nadelspitze in den Ultraschallbildern überprüfen.
   HINWEIS: Die Menge des injizierten Virus pro Injektionsstelle darf 15 μL nicht überschreiten, um physische Schäden am Myokardgewebe zu vermeiden.
10. Die Nadel aus dem Herzen zurückziehen und für eine zweite und dritte Injektion der gleichen Virenmenge in andere Bereiche des linken Ventrikels einführen.
    HINWEIS: Die Gesamtanzahl der Injektionsstellen richtet sich nach dem experimentellen Design. Wenn eine fokale Transgenexpression erforderlich ist, genügt eine einzige Injektion; bei Bedarf einer diffuseren Transgenexpression sind in der Regel mehrere Injektionsstellen (drei bis fünf) erforderlich.
11. Nach Abschluss der Injektionen das Tier in seinen Käfig zurückbringen.
12. Das Tier sorgfältig überwachen, bis es ausreichend bei Bewusstsein ist, um die Sternumlage beizubehalten, und es dann in den Aufzuchtraum zurückbringen.
13. Buprenorphinhydrochlorid (0,1 mg/kg, zweimal täglich für Mäuse, 0,05 mg/kg, zweimal täglich für Ratten, subkutan) dem Tier für die folgenden 2 Tage verabreichen. Die Tiere in das Tierzuchtgefäß zurückbringen und täglich auf ungewöhnliche Anzeichen von Schmerzen oder Belastung überwachen; falls solche auftreten, die Tiere gemäß den Protokollen des institutionellen Tierversuchsausschusses behandeln.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
30 G ½ PrecisionGlide-Nadel	Becton Dickinson (BD)	305106
Adeno-assoziiertes Virus (grünes Fluoreszenzprotein (GFP) exprimierendes AAV9)	Vector Biolabs	7007
Adenovirus (Ad-GFP)	Vector Biolabs	1060
Biosicherheitswerkbank (Stufe II)	Microzone Corporation	N/A	Modell #: BK-2-4
Buprenorphin	Vetergesic	DIN 02342510
Haarschneider	WAHL Clipper Corporation	78001
Hamilton-Spritze	Sigma-Aldrich	20701	705 LT, Volumen 50 μL
Heizplatte	Life Brand	E12107
Isofluran	Fresenius Kabi Ltd.	M60303
Mäuse (Ctnnb1flox/flox)	Jackson Labs	4152
Mäuse (αMHC-MerCreMer)	Jackson Labs	5650
Augensalbe	Systane	DIN 02444062
Ratte (Sprague-Dawley, männlich)	Charles River	400
Skalpellklingen	Fine Science Tools	10010-00
Skalpellgriff	Fine Science Tools	10007-12
VEVO3100 Präklinisches Bildgebungssystem	VisualSonic Inc.	N/A