Transduktion einer humanisierten Rattenleber unter Verwendung von adeno-assoziierten Virusvektoren

Zusammenfassung

Quelle: Hiller, T., et al. Untersuchung viraler Vektoren in einem dreidimensionalen Lebermodell, das mit der humanen hepatozellulären Karzinomzelllinie HepG2 wiederbesiedelt wurde. J. Vis. Exp., (2016)

Dieses Video zeigt die genvermittelte Übertragung mittels adeno-assoziierter Viren in einem humanisierten Rattenleber-Gerüst. Der Vektor überträgt ein Transgen, das einen fluoreszierenden Reporter und RNA zur Genstilllegung kodiert, mittels rezeptorvermittelter Endozytose in Leberzellen. Dieses Modell ermöglicht eine effiziente Transduktion in einem durchströmten 3D-Lebergewebesystem.

Protokoll

Transduktion des Lebermodells

1. Stellen Sie die adenoassoziierte Virus-(AAV-)Vektorlösung durch Zugabe des entsprechenden Volumens an phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf eine Endkonzentration von 2,7 x 10¹³ Vektor-Genomen in 5 ml ein.
2. Trennen Sie die Leber vom Medienkreislauf, indem Sie die Schläuche von der Kanüle entfernen. Verbinden Sie eine 5-ml-Spritze mit der Kanüle der Pfortader und injizieren Sie die gesamte AAV-Vektorlösung (5 ml).
3. HINWEIS: Optional kann Phenolrot (5 µg/ml) zugegeben werden, um die Verteilung der AAV-Vektorlösung in der Leber zu verfolgen.
4. Inkubieren Sie 1 Stunde lang ohne Pumpbetrieb. Erhöhen Sie die Flussrate schrittweise, beginnend mit 1,25 ml/min für 10 min; 2,5 ml/min für 20 min und 3,75 ml/min für 30 min. Kultivieren Sie die rekellularisierte Ratte-Leber über einen Zeitraum von 6 Tagen.
5. HINWEIS: Ersetzen Sie jeden zweiten Tag ein Drittel des Mediums durch frisches Medium (50 ml). Entnehmen Sie Proben des Kulturmediums, um physiologische Parameter wie die Aktivität der Lactatdehydrogenase, den pH-Wert der Mediumproben sowie die Konzentration von Glukose und Laktat zu messen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Brutschrank	Fraunhofer	/
Peristaltische Pumpe	Fraunhofer	/
Flansch mit Nut	Duran	2439454
O-Ring transparent	Duran	2922551
Schnellkupplung	Duran	2907151
Flache Flanschabdeckung	Duran	2429857
Gewinderohr	Duran	2483802
Gewinderohr	Duran	2483602
Silikon-Dichtungsring	Duran	2862012
Schraubverschluss	Duran	2924013
Schraubverschluss	Duran	2924008
Schraubverschluss mit Öffnung	Duran	2922709
Schraubverschluss mit Öffnung	Duran	2922705
Filter	Sarstedt	831,826,001
Silikon-Schlauch	VWR	228-1500
Schlauchverbinder	Ismatec	ISM556A
Biokompatibler Schlauch	Ismatec	SC0736
Kulturgefäße T175	Greiner bio-one	660 160
RPMI 1640	BioWest SAS (Th. Geyer)	L0501-500
Glutamin	BioWest SAS (Th. Geyer)	X0551-100
Trypsin	BioWest SAS (Th. Geyer)	L0940-100
Penicillin/Streptomycin	BioWest SAS (Th. Geyer)	L0022-100
Fötales Kälberserum	cc pro	S-10-M
HepG2	DSMZ	ACC 180