Bestätigung der viralen Transduktion in rezellularisierter Rattenleber mittels immunhistochemischer Färbung

Zusammenfassung

Quelle: Hiller, T. et. al. Untersuchung viraler Vektoren in einem dreidimensionalen Lebermodell, das mit der humane hepatzellulären Karzinomzelllinie HepG2 wiederbesiedelt wurde. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video zeigt die immunhistochemische Färbung zur Beurteilung des viralen Gentransfers in einem rekellularisierten Rattenlebermodell. Die Reporterexpression, bestätigt durch Antikörpernachweis und Ko-Lokalisation mit Kernfärbung, weist auf eine erfolgreiche virale Transduktion in den Zellen hin.

Protokoll

1. Transduktion der rekultivierten Ratte-Leber

1. Large-Scale Production of viral vector derived from adeno-associated viruses (AAV vector)
   1. Produce, purify, and quantify AAV vectors:
      1. Erzeugen Sie AAV-Vektoren in Rollflaschen und reinigen Sie diese mittels Iodixanol-Dichtegradientenzentrifugation. Entfernen Sie restliches Iodixanol durch Filtration über PD10-Gelfiltrationssäulen. Bestimmen Sie die AAV-Vektor-Konzentration mittels quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) unter Verwendung genomischer AAV-DNA als Standard.
         HINWEIS: Der selbstkomplementäre, pseudotypisierte AAV2/6-Vektor, der in der vorliegenden Studie verwendet wurde, kodiert für das emeraldgrüne fluoreszierende Reportergenprotein EmGFP als Reporter zur Demonstration der Transduktionseffizienz sowie für eine Expressionskassette mit kurzer Haarnadel-RNA (shRNA) zum Knockdown eines endogen exprimierten Gens (humanes Cyclophilin B (hCycB), Abbildung 1). Stellen Sie eine ausreichende Menge an pseudotypisierten scAAV-Vektoren des Serotyps 6 (2,7 × 10¹³ AAV-Vektoren pro Lebermodell) sicher.
2. Transduktion des Lebermodells
   1. Stellen Sie die AAV-Vektorlösung auf eine Endkonzentration von 2,7 × 10¹³ Vektorgenome in 5 mL ein, indem Sie das entsprechende Volumen an phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) hinzufügen.
   2. Trennen Sie die Leber vom Medienkreislauf, indem Sie die Schläuche vom Kanülenschlauch abnehmen. Verbinden Sie eine 5-mL-Spritze mit der Kanüle der Pfortader und injizieren Sie die komplette AAV-Vektorlösung (5 mL).
      HINWEIS: Fügen Sie optional Phenolrot (5 µg/ml) hinzu, um die Verteilung der AAV-Vektorlösung in der Leber verfolgen zu können.
   3. Inkubieren Sie 1 Stunde lang ohne Pumpbetrieb. Erhöhen Sie die Flussrate schrittweise, beginnend mit 1,25 ml/min für 10 min; 2,5 ml/min für 20 min und 3,75 ml/min für 30 min. Kultivieren Sie die rekellularisierte Ratteleber über einen Zeitraum von 6 Tagen.

2. Bewertung der rekolonisierten, transduzierten Ratte-Leber

1. Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (HE-Färbung) und immunhistochemische Analyse
   1. Entnehmen Sie Proben (0,5 x 0,5 x 1,5–2 cm) aus jedem Leberlappen mithilfe eines Skalpells.
   2. Incubieren Sie die Proben 1,5 Stunden bei 4 °C in einer Lösung aus 4 % Paraformaldehyd (PFA) + 4 % Saccharose. (Vorsicht: PFA ist toxisch und krebserregend. PFA stets im Abzug verwenden und geeignete Schutzkleidung tragen.) Waschen Sie dreimal mit PBS (1 Minute pro Waschschritt) und inkubieren Sie über Nacht bei 4 °C in 8 % Saccharose.
   3. Geben Sie das Fixiermedium in Kunststoff-Cryomulden und legen Sie die Proben blasenfrei in das Medium. Fügen Sie so viel Fixiermedium hinzu, dass die Probe vollständig bedeckt ist. Lagern Sie die eingebetteten Proben bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C.
   4. Stellen Sie Gefrierschnitte (10 µm) mit einem Kryotom her. Beurteilen Sie die Rezellularisierung mittels Hämatoxylin- und Eosin-Färbung. Beurteilen Sie die Transduktionseffizienz mittels immunhistochemischer Färbung für das Gen der Untersuchung (hier: EmGFP).

Ergebnisse

Abbildung 1. Karte des selbstkomplementären, pseudotypisierten AAV2/6-Vektors, der in der vorliegenden Studie verwendet wurde. Das Genom besteht aus den invertierten terminalen Wiederholungen (ITR) von AAV2 und kodiert EmGFP unter Kontrolle des CMV-Promotors sowie eine shRNA unter Kontrolle eines U6-Promotors.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Tissue-Tek O.C.T.	Weckert-Labortechnik	600001
Cryoschneideform 15 x 15 x 5 mm	Sakura	4566
Brutschrank	Fraunhofer	/