Erzeugung von Conditional-Knockdown-Zellen unter Verwendung eines tetracyclin-responsiven lentiviralen shRNA-Expressionssystems

Zusammenfassung

Quelle: Kubala, M. H. & DeClerck, Y. A. Bedingte Herunterregulation der Genexpression in Krebszelllinien zur Untersuchung der Rekrutierung von Monozyten/Makrophagen in das Tumormikroumfeld. J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video demonstriert die Erzeugung bedingter Knockdown-Krebszelllinien unter Verwendung eines Tet-induzierbaren lentiviralen shRNA-Systems. Es erläutert die Schritte für die virale Transduktion, die antibiotische Selektion und die durch Doxycyclin induzierte Gen-Silenzierung.

Protokoll

1. Erzeugung stabil transduzierter Zelllinien
   1. Säen Sie HCT116-Darmkrebszellen und MDA-MB-231-Brustkrebszellen mit 50.000 Zellen/Vertiefung in Dulbeccos modifiziertem Eagles Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fetalem Kälberserum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep), in einer 12-Loch-Platte. Inkubieren Sie bei 37 °C bei 5 % CO₂₂ bis die Zellen 60–70 % konfluent sind.
   2. Washen Sie die Zellen mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und geben Sie 1 mL Virus-haltiges Medium zu den Krebszellen hinzu. Inkubieren Sie über Nacht bei 37 °C bei 5 % CO₂₂Als Kontrolle 1 mL frisches DMEM-Medium, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Pen/Strep, zu 2 Wells mit Krebszellen hinzufügen.
   3. Entfernen Sie das virushaltige Medium vorsichtig durch Absaugen. Waschen Sie die Zellen mit PBS und erneuern Sie das Medium durch DMEM mit 10 % (v/v) tetracyklinfreiem (Tet-freiem) FBS und 1 % Pen/Strep.
   4. Nach 72 h die Zellen mit PBS waschen und das Medium wechseln zu DMEM mit 10 % (v/v) Tet-freiem FBS und 1 % Pen/Strep, 1 µg/mL Puromycin zur Selektion der virus-transduzierten Zellen.
      1. Abhängig von der verwendeten Zelllinie die Puromycin-Konzentration für eine optimale Selektion anpassen, indem ein Konzentrationsbereich an Puromycin (0,1, 0,5, 1, 2 und 5 µg/mL) getestet und die niedrigste Konzentration gewählt wird, bei der keine Kontrollzellen nach 3 Tagen Kultur überleben. 5 µg/mLin nicht transduzierten Zellen und Auswahl der niedrigsten Konzentration, bei der nach 3 Tagen Kultur keine Kontrollzellen überleben.
   5. Selektieren Sie virus-transduzierte Zellen, indem Sie die Zellen 3–14 Tage in Gegenwart von Puromycin kultivieren. Als Kontrollen bereiten Sie zwei zusätzliche Wells mit nicht-transduzierten Zellen vor, eines mit Medium, das Puromycin enthält, und eines ohne Puromycin. Beobachten Sie eine partielle Abtötung der Zellen durch Puromycin im Well mit virus-transduzierten Zellen im Vergleich zu den Kontrollwells.
      HINWEIS: Nicht-transduzierte Zellen wachsen in Gegenwart von Puromycin nicht.
   6. Überprüfen Sie die Effizienz des bedingten Knockdowns (KD) in den Puromycin-resistenten kolorektalen Krebszellen HCT116 und den Brustkrebszellen MDA-MB-231.
      HINWEIS: Die wirksame Konzentration von Doxycyclin variiert je nach verwendeter Zelllinie und muss titriert werden (typischerweise zwischen 100 ng/mL und 2 µg/mL).
      1. Bestimmen Sie die Doxycyclin-Konzentration, die für die Zellen nicht toxisch ist, aber wirksam die Expression des Proteins von Interesse herunterreguliert. In diesem Protokoll 1 µg/mL wurde erfolgreich in vitro verwendet.
      2. Kultivieren Sie die Zellen 72 h in Gegenwart und Abwesenheit von 0,1, 1 und 2 µg/mL Doxycyclin. Überprüfen Sie das Expressionniveau des herunterregulierten Proteins (hier, Plasminogen-Aktivator-Inhibitor 1 (PAI-1)) im Zelllysat mittels Western-Blot-Analyse. Vergleichen Sie HCT116- und MDA-MB-231-Zellen, die bedingt short hairpin RNA (shRNA) exprimieren, mit scrambled Kontrollzellen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Tet-pLKO-puro lentiviraler Vektor	Addgene	21915
FBS (Tetracyclin-frei)	Omega Scientific	FB-15
psPAX-Vektor	Addgene	12260
pMD2.G-Vektor	Addgene	12259
HEK293-Zellen	ATCC	CRL-1573
PBS	Corning	21-031-CV
Dulbecco’s modifiziertes Eagle-Medium (DMEM)	Corning	10-013-CV
phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Corning	21-031-CV
4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES)	Sigma-Aldrich	H3375
Puromycin	Sigma-Aldrich	P9620
Doxycyclin-Hydrochlorid	Sigma-Aldrich	D9891-25g
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)	Corning	10-040-CV
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122