Herstellung einer virusangereicherten Suspension mittels stufenweiser Saccharose-Zentrifugation

Zusammenfassung

Quelle: Vijayraghavan, S. und Kantor, B. Ein Protokoll zur Herstellung integrase-defizienter lentiviraler Vektoren für das gezielte Ausschalten von Genen mittels CRISPR/Cas9 in teilenden Zellen. J. Vis. Exp., (2017)

Dieses Video demonstriert ein zweistufiges Ultrazentrifugationsverfahren unter Verwendung von Saccharosegradienten und -kissen zur Reinigung und Anreicherung von Viruspartikeln aus Zellkulturüberständen. Das Verfahren ermöglicht die Trennung anhand der Schwimmdichte und erlaubt die Gewinnung intakter Viren, die für nachfolgende Anwendungen geeignet sind.

Protokoll

1. Konzentration von Viruspartikeln durch Ultrazentrifugation

HINWEIS: Wir verwenden ein Doppelsaccharose-Verfahren der Reinigung, das zwei Schritte umfasst: einen Saccharosegradientenschritt und einen Saccharosekissenschritt (Abbildung 1).

1. Füllen Sie die konischen Ultrazentrifugenröhrchen in der folgenden Reihenfolge, um einen Saccharosegradienten herzustellen: 0,5 mL 70 % Saccharose (gelöst in 1x Phosphat-gepufferter Salzlösung [PBS]), 0,5 mL 60 % Saccharose (gelöst in DMEM), 1 mL 30 % Saccharose (gelöst in Dulbecco’s modifiziertem Eagle-Medium [DMEM]) und 2 mL 20 % Saccharose (gelöst in 1x PBS).
2. Fügen Sie das virushaltige Überstandsvolumen vorsichtig zum Gradienten hinzu. Da das Gesamtvolumen des Überstandes von vier 15-cm-Platten 100 mL beträgt, verwenden Sie sechs Ultrazentrifugenröhrchen pro Zentrifugation, um das gesamte Volumen des virushaltigen Überstandes zu verarbeiten.
   1. Jedes für diesen Schritt verwendete Ultrazentrifugenröhrchen hat ein Fassungsvermögen von bis zu 30 mL (einschließlich des Saccharosevolumens). Verteilen Sie den viralen Überstand gleichmäßig auf die Röhrchen und lassen Sie mindestens 10 % Freiraum, um Verschütten zu vermeiden.
   2. Passen Sie das Kulturvolumen bei Verwendung von mehr als vier 15-cm-Platten pro Experiment auf etwa 20–22 mL pro Platte an, sodass das endgültige Volumen des gepoolten virushaltigen Überstandes problemlos in sechs Ultrazentrifugenröhrchen Platz findet.
   3. Füllen Sie die Ultrazentrifugenröhrchen mindestens zu drei Vierteln ihrer Gesamtkapazität, da andernfalls während der Zentrifugation ein Bruch der Röhrchen auftreten kann, was zu einem möglichen Verlust der Probe und/oder Schäden an der Ausrüstung führen kann.
3. Wägen Sie die Röhrchen mit 1x PBS aus und zentrifugieren Sie die Proben bei 70.000 × g für 2 h bei 17 °C
   HINWEIS: Um eine Störung der Saccharoseschicht während der Beschleunigung zu verhindern, stellen Sie die Ultrazentrifuge so ein, dass der Rotor während der ersten 3 Minuten der Zentrifugation langsam auf 200 min⁻¹ beschleunigt wird. Stellen Sie analog dazu am Ende der Zentrifugation ein, dass der Rotor über 3 Minuten langsam von 200 min⁻¹ auf 0 min⁻¹ abgebremst wird.
4. Sammeln Sie vorsichtig die 30–60 %igen Saccharose-Fraktionen in saubere Röhrchen (Abbildung 1). Geben Sie kalte 1x PBS zu den gepoolten Fraktionen hinzu und stellen Sie das Volumen auf 100 mL ein; mischen Sie durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren.
5. Fahren Sie mit dem Saccharosekissen-Schritt fort, indem Sie die virale Aufbereitung vorsichtig auf ein Saccharosekissen aufschichten. Fügen Sie hierzu 4 mL 20 %iger Saccharose (in 1x PBS) in das Röhrchen hinzu, gefolgt von jeweils etwa 20–25 mL viraler Lösung pro Röhrchen. Falls die Röhrchen weniger als zu drei Vierteln gefüllt sind, ergänzen Sie mit steriler 1x PBS.
6. Wägen Sie die Röhrchen sorgfältig aus und zentrifugieren Sie die Proben wie zuvor bei 70.000 × g für 2 h bei 17 °C. Gießen Sie den Überstand ab und lassen Sie die restliche Flüssigkeit abtropfen, indem Sie die Röhrchen auf Papiertüchern umgedreht abstellen.
7. Aspirieren Sie verbleibende Tropfen, um sämtliche Flüssigkeit aus dem Pellet zu entfernen. An diesem Punkt sollten die virushaltigen Pellets gerade noch als kleine durchscheinende Stellen sichtbar sein.
8. Lösen Sie die Pellets auf, indem Sie 70 µL 1x PBS zum ersten Röhrchen hinzufügen und die Suspension gründlich auf- und abpipettieren, anschließend die Suspension in das nächste Röhrchen überführen und wie zuvor mischen, bis alle Pellets resuspendiert sind.
9. Spülen Sie die Röhrchen mit weiteren 50 µL kalter 1x PBS aus und mischen Sie wie zuvor. Stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen der endgültigen Suspension etwa 120 µL beträgt und leicht trüb erscheint; klären Sie diese durch Zentrifugation bei 10.000 × g für 30 s in einer Tischmikrozentrifuge.
10. Überführen Sie den Überstand in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen, portionieren Sie 10-µL-Aliquots und lagern Sie diese bei -80 °C.
    HINWEIS: Vermeiden Sie wiederholte Einfrier- und Auftauzyklen der Lentivirusproben. Sofern keine Zentrifugation erforderlich ist, sollten die verbleibenden Schritte unter Gewebekulturhauben oder in dafür vorgesehenen Gewebekultur-Räumen unter Anwendung geeigneter Biosicherheitsmaßnahmen durchgeführt werden.

Ergebnisse

Abbildung 1: Konzentration der viralen Partikel mittels des Doppel-Sucrose-Gradienten-Verfahrens. Vom Überstand (ÜS) gewonnene virale Partikel werden auf einen Sucrose-Gradienten aufgetragen. Der Gradient wird mit 70 %, 60 %, 30 % und 20 %igen Sucrose-Lösungen erzeugt. Nach der Zentrifugation werden die Partikel aus den Sucrose-Fraktionen von 30–60 % gewonnen, anschließend auf ein 20 %iges Sucrose-Kissen aufgetragen und präzipitiert. Das endgültige Pellet, das die gereinigten viralen Partikel enthält, wird in 1x PBS resuspendiert, um es weiterzuverwenden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ausrüstung
Optima XPN-80 Ultrazentrifuge	Beckman Coulter	A99839
Allegra 25R Tischzentrifuge	Beckman Coulter	369434
Kegelförmige Ultrazentrifugenröhrchen	Seton Scientific	5067
Kegelröhrchenadapter	Seton Scientific	PN 4230
SW32Ti Schwingkopfrotor	Beckman Coulter	369650
50-mL-Kegelröhrchen für die Zentrifuge	Corning	430291
Zellkulturpipetten, 25 mL	Corning	4489