Bestimmung des Lentivirustiters mittels eines Enzyme-Linked Immunosorbent Assays

Zusammenfassung

Quelle: Vijayraghavan, S., et al. Protokoll zur Herstellung integrase-defizienter lentiviraler Vektoren für das gezielte Ausschalten von Genen mittels CRISPR/Cas9 in teilenden Zellen. J. Vis. Exp. (2017).

Dieses Video demonstriert die Verwendung eines p24-ELISA zur Abschätzung der viralen Titer von lentiviralen Vektoren. Der Test beinhaltet das Lyse von Viruspartikeln, um p24 freizusetzen, die Bindung mittels spezifischer Antikörper und den Nachweis über ein mit Peroxidase gekoppeltes System, das eine messbare Farbänderung erzeugt. Durch den Vergleich der Absorptionswerte der Proben mit einer Standardkurve wird der virale Titer quantifiziert.

Protokoll

1. Bestimmung der viralen Titer

1. p24 (Human Immunodeficiency Virus (HIV)-1 p24-Kapsidprotein) -Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)-MethodeHINWEIS: Der Assay wird unter Verwendung von Hochbindungs-96-Well-Platten gemäß den Anweisungen des NIH AIDS Vaccine Program für das HIV-1 p24 Antigen Capture Assay Kit (siehe Tabelle der Materialien) mit Modifikationen durchgeführt.
   1. Am nächsten Tag die Wells dreimal mit jeweils 200 µL 0,05 % Tween 20 in kaltem PBS (PBS-T-Lösung) waschen. Die Platte mit 100 µL monoklonalem anti-p24-Antikörper in einer Verdünnung von 1:1500 in 1x PBS beschichten und über Nacht bei 4 °C inkubieren.
   2. Um unspezifische Bindungen zu unterdrücken, die Platte mit 200 µL 1 % BSA in PBS blockieren; dreimal mit jeweils 200 µL 0,05 % Tween 20 in kaltem PBS (PBS-T-Lösung) waschen und mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.
   3. Proben vorbereiten: Bei konzentrierten Vektorpräparationen 1 µL der Probe 100-fach verdünnen, indem 89 µL dd-H2O und 10 µL Triton X-100 (endgültige Konzentration 10 %) hinzugefügt werden. Bei nicht konzentrierten Präparationen zehnfach verdünnte Proben herstellen (80 µL dd-H2O und 10 µL Triton X-100 (endgültige Konzentration 10 %) zu 10 µL der Probe hinzufügen).HINWEIS: Die Proben können an diesem Punkt für einen längeren Zeitraum bei -20 °C gelagert werden, um sie später zu verwenden.
   4. HIV-1-Standards durch zweifache serielle Verdünnung (mit einer Startkonzentration von 5 ng/mL) herstellen.
   5. Konzentrierte Proben (aus 1:100 vorgedünnten Ansätzen) in RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium), ergänzt mit 0,2 % Tween 20 und 1 % BSA, verdünnen, um Verdünnungen von 1:10.000, 1:50.000 und 1:250.000 zu erhalten. Nicht konzentrierte Proben (aus 1:10 vorgedünnten Ansätzen) in RPMI 1640, ergänzt mit 0,2 % Tween 20 und 1 % BSA, verdünnen, um Verdünnungen von 1:500, 1:2.500 und 1:12.500 herzustellen.
   6. Die Proben in Dreifachbestimmung auf die Platte auftragen und über Nacht bei 4 °C inkubieren.
   7. Am nächsten Tag die Wells sechsmal waschen und 4 Stunden lang bei 37 °C mit 100 µL polyklonalem Kaninchen-anti-p24-Antikörper, 1:1000 in RPMI 1640, 10 % FBS, 0,25 % BSA und 2 % normalem Mausserum (NMS) verdünnt, inkubieren.
   8. Sechsmal wie oben beschrieben waschen und 1 Stunde lang bei 37 °C mit Ziegen-anti-Kaninchen-Horseradish-Peroxidase-IgG, 1:10.000 in RPMI 1640 ergänzt mit 5 % normalem Ziegenserum, 2 % NMS, 0,25 % BSA und 0,01 % Tween 20, verdünnt, inkubieren.
   9. Die Platte wie oben beschrieben waschen und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit TMB (3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin)-Peroxidase-Substrat inkubieren.
   10. Die Reaktion durch Zugabe von 100 µL 1 N HCL stoppen. Die Absorption der Proben bei 450 nm mithilfe eines Absorptions-Plattenlesegeräts messen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Reagenzien für p24-ELISA
Monoklonaler Anti-p24-Antikörper	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	3537
HIV-1-Standards	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	SP968F
Polyklonaler Kaninchen-Anti-p24-Antikörper	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	SP451T
Ziegen-Anti-Kaninchen-Horseradish-Peroxidase-IgG	Sigma Aldrich	12-348	Arbeitskonzentration 1:1500
Normales Mausserum, steril, 500 mL	Equitech-Bio	SM30-0500
Ziegenserum, steril, 10 mL	Sigma	G9023	Arbeitskonzentration 1:1000
TMB-Peroxidase-Substrat	KPL	5120-0076	Arbeitskonzentration 1:10.000