Erzeugung von rekombinanten adeno-assoziierten Viren durch Plasmid-Transfektion

Zusammenfassung

Quelle: Ding, J., et al. Herstellung von rAAV9 zur Überexpression oder Genabschaltung in Mausherzen. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video zeigt die Herstellung rekombinanter adeno-assoziierter Viruspartikel mittels Plasmid-Transfektion in Säugetierzellen. Es verdeutlicht die koordinierte Expression der Rep-, Cap- und Hilfsproteine, die die virale Genomreplikation und die Kapsid-Assembly im Zellkern antreiben.

Protokoll

1. Transfektion von HEK293-Zellen mit Plasmiden des rekombinanten adeno-assoziierten Virus 9 (rAAV9)

1. Stellen Sie eine 1 µg/µl Lösung von linearem Polyethylenimin (PEI) her. Lösen Sie PEI-Pulver in endotoxinfreiem dH₂O, das auf 70–80 °C erhitzt wurde. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur (RT) wird die Lösung mit 1 M HCl auf pH 7,0 neutralisiert. Die Lösung wird filtriersterilisiert (0,22 µm). Portionieren Sie die 1 µg/µl PEI-Stammlösung (1.400 µl/Röhrchen) und lagern Sie die Lösung bei -20 °C.
2. Kultivieren Sie HEK293-Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagles Medium (DMEM) mit 10 % Fötales Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin. Kultivieren Sie die Zellen in einem 37 °C Inkubator mit 5 ± 0,5 % Kohlendioxid (CO₂).
3. Am Tag 0 säen Sie HEK293-Zellen in zehn 150-mm-Dishs aus, 18–20 Stunden vor der Transfektion, indem Sie > 90 % konfluente Zellen im Verdünnungsverhältnis 1:2 aufteilen.
   HINWEIS: Am Tag 1 sollten die Zellen eine Konfluenz von 90 % erreichen.
4. Am Tag 1 transfizieren Sie HEK293-Zellen mit dem rAAV9-Plasmid (z. B. rAAV9.cTNT::GFP- oder rAAV6.U6::shRNA-Konstrukte), dem Ad-Hilfsplasmid und dem AAV-Rep/Cap-Plasmid unter Verwendung von PEI.
   1. Für 10 Schalen mit Zellen bei 90 % Konfluenz werden 70 µg AAV-Rep/Cap-Plasmid, 70 µg rAAV9-Plasmid und 200 µg Ad-Hilfsplasmid in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen gemischt.
   2. Falls die Zellen weniger konfluent sind, passen Sie die DNA-Menge proportional an. Wenn beispielsweise die Zellen 75 % konfluent sind, reduzieren Sie die DNA-Menge entsprechend (75/90 der in Schritt 1.4.1 angegebenen Menge): Mischen Sie 70 x 75/90 = 58,3 µg AAV-Rep/Cap-Plasmid, 70 x 75/90 = 58,3 µg rAAV9-Plasmid und 200 x 75/90 = 166,7 µg Ad-Hilfsplasmid in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen.
   3. Geben Sie 49 ml RT-DMEM (ohne FBS) zu dem 50-ml-Röhrchen und mischen Sie gut.
   4. Geben Sie 1.360 µl PEI-Lösung hinzu, um ein PEI:DNA-Verhältnis (Volumen/Masse) von 4:1 zu erreichen. Mischen Sie gut. Inkubieren Sie 15–30 Minuten bei Raumtemperatur.
   5. Geben Sie 5 ml der in Schritt 1.4.4 hergestellten Mischung in jede 150-mm-Schale (50 ml der Mischung für zehn 150-mm-Schalen).
5. Kultivieren Sie die Zellen 60–72 Stunden lang in einem 37 °C Inkubator mit 5 ± 0,5 % CO₂.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Polyethylenimin, linear (MW 25.000)	Polysciences, Inc.	#23966-2
Röhrchen, Polypropylen, 36,2 ml, 25 x 87 mm, (Menge 56)	Beckman Coulter, Inc	# 362183
DMEM-Medium	Fisher Scientific	SH30243FS
Fetales Rinderserum	Atlanta Biologicals	S11150
rAAV9-Vektor	Penn Vector Core	P1967