Reinigung rekombinanter Viruspartikel aus transfizierten menschlichen Nierenzellen

Zusammenfassung

Quelle: Ding, J. et. al., Herstellung von rAAV9 zur Überexpression oder Herunterregulation von Genen in Mausherzen. J. Vis. Exp. (2016)

In diesem Video wird die Reinigung rekombinanter Viruspartikel aus transfizierten menschlichen Nierenzellen gezeigt. Das Virus wird durch Gefrier-Tauch-Lyse freigesetzt und mittels Iodixanol-Gradienten unter Verwendung der Blockcopolymer-unterstützten Filtration gereinigt.

Protokoll

1. Transfektion von HEK293-Zellen mit Plasmiden des rekombinanten adenoassoziierten Virus 9 (rAAV9)
   1. Bereiten Sie eine lineare Polyethylenimin (PEI)-Lösung mit 1 µg/µl vor. Lösen Sie PEI-Pulver in endotoxinfreiem dH₂O, das auf 70–80 °C erhitzt wurde. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur (RT) wird die Lösung mit 1 M Salzsäure (HCl) auf pH 7,0 neutralisiert. Die Lösung wird sterilfiltriert (0,22 µm). Portionieren Sie die 1 µg/µl PEI-Grundlösung (1.400 µl/Probe) und lagern Sie sie bei -20 °C.
   2. Kultivieren Sie HEK293-Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagles Medium (DMEM) mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin. Kultivieren Sie die Zellen in einem 37 °C warmen Inkubator mit 5 ± 0,5 % Kohlendioxid (CO₂).
   3. Am Tag 0 säen Sie HEK293-Zellen in zehn 150-mm-Dishs aus, 18–20 Stunden vor der Transfektion, indem Sie > 90 % konfluente Zellen im Verdünnungsverhältnis 1:2 aufteilen.
      HINWEIS: Am Tag 1 sollten die Zellen eine Konfluenz von 90 % erreichen.
   4. Am Tag 1 transfizieren Sie die HEK293-Zellen mit dem rAAV9-Plasmid (z. B. rAAV9.cTNT::GFP oder rAAV6.U6::shRNA-Konstrukte), dem Ad-Helfer-Plasmid und dem AAV-Rep/Cap-Plasmid unter Verwendung von PEI.
      1. Für 10 Schalen mit Zellen bei 90 % Konfluenz mischen Sie 70 µg AAV-Rep/Cap-Plasmid, 70 µg pfrAAV9-Plasmid und 200 µg Ad-Helfer-Plasmid in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen.
      2. Falls die Zellen weniger konfluent sind, passen Sie die DNA-Menge proportional an. Wenn die Zellen beispielsweise 75 % konfluent sind, reduzieren Sie die DNA-Menge entsprechend (75/90 der in Schritt 2.4.1 angegebenen Menge): Mischen Sie 70 × 75/90 = 58,3 µg AAV-Rep/Cap-Plasmid, 70 × 75/90 = 58,3 µg rAAV9-Plasmid und 200 × 75/90 = 166,7 µg Ad-Helfer-Plasmid in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen.
      3. Geben Sie 49 ml RT-DMEM (ohne FBS) zu dem 50-ml-Röhrchen und mischen Sie gründlich.
      4. Geben Sie 1.360 µl PEI-Lösung hinzu, sodass das Verhältnis PEI:DNA (Volumen/Gewicht) 4:1 beträgt. Mischen Sie gründlich. Inkubieren Sie 15–30 Minuten bei Raumtemperatur.
      5. Geben Sie 5 ml der in Schritt 1.4.4 hergestellten Mischung in jedes 150-mm-Dish (insgesamt 50 ml für zehn 150-mm-Dishs).
   5. Kultivieren Sie die Zellen 60–72 Stunden lang in einem 37 °C warmen Inkubator mit 5 ± 0,5 % CO₂.
2. Ernte transfizierter HEK293-Zellen und Reinigung von rAAV9-Vektoren
   1. Ernten Sie die Zellen 60–72 Stunden nach der Transfektion. Lösen und suspendieren Sie die Zellen in den Schalen durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren mit dem Kulturmedium. Überführen Sie alle Zellsuspensionen in sterile 50-ml-Röhrchen.
   2. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 × g für 5 Minuten. Resuspendieren Sie den Zellpellet in jedem Röhrchen mit 5 ml gepuffertem Kochsalzlösung (PBS) und vereinigen Sie alle Zellsuspensionen in einem 50-ml-Röhrchen.
   3. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 × g für 5 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand. An dieser Stelle können Sie den Zellpellet bei -80 °C lagern oder die AAV unmittelbar aus dem Pellet reinigen, wie in den Schritten 2.4–2.15 beschrieben.
   4. Bereiten Sie den Lysepuffer vor: 150 mM Natriumchlorid (NaCl) und 20 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Hydrochlorid (Tris-HCl, pH 8,0). Sterilfiltrieren Sie den Puffer (0,22 µm). Lagern Sie den Puffer bei 4 °C.
   5. Resuspendieren Sie den Pellet mit 10 ml Lysepuffer.
   6. Frieren Sie das Lysat bei -80 °C oder in einem Trockeneis/Ethanol-Bad ein, und tauen Sie es dann bei 37 °C auf. Vortexen Sie 1 Minute lang. Wiederholen Sie den Einfrier- und Auftauvorgang dreimal.
   7. Geben Sie eine Magnesiumchlorid (MgCl₂)-Lösung zum aufgetauten Lysat hinzu (Endkonzentration von MgCl₂ im Lysat: 1 mM). Fügen Sie die Nuklease hinzu, sodass eine Endkonzentration von 250 U/ml erreicht wird. Inkubieren Sie 15 Minuten bei 37 °C, um DNA-/Proteinaggregationen aufzulösen.
      HINWEIS: Falls die DNA-/Proteinaggregationen nach Behandlung mit Nuklease oder Endonuklease nicht aufgelöst sind, homogenisieren Sie das Lysat 20-mal mit einem Dounce-Homogenisator.
   8. Zentrifugieren Sie die Probe bei 4.800 × g für 20 Minuten bei 4 °C. Sammeln Sie den Überstand.
   9. Bereiten Sie inzwischen die Iodixanol-Gradientenlösung vor:
      1. Stellen Sie die 17 %-ige Gradientenlösung her, indem Sie 5 ml 10x PBS, 0,05 ml 1 M MgCl₂, 0,125 ml 1 M Kaliumchlorid (KCl), 10 ml 5 M NaCl und 12,5 ml Dichtegradientenmedium mischen. Stellen Sie das Gesamtvolumen mit H₂O auf 50 ml ein.
      2. Stellen Sie die 25 %-ige Lösung her, indem Sie 5 ml 10x PBS, 0,05 ml 1 M MgCl₂, 0,125 ml 1 M KCl, 20 ml Dichtegradientenmedium und 0,2 ml 0,5 % (w/v) Phenolrot mischen. Stellen Sie das Gesamtvolumen mit H₂O auf 50 ml ein.
      3. Stellen Sie die 40 %-ige Lösung her, indem Sie 5 ml 10x PBS, 0,05 ml 1 M MgCl₂, 0,125 ml 1 M KCl und 33,3 ml Dichtegradientenmedium mischen. Stellen Sie das Gesamtvolumen mit H₂O auf 50 ml ein.
      4. Stellen Sie die 60 %-ige Lösung her, indem Sie 0,05 ml 1 M MgCl₂, 0,125 ml 1 M KCl, 50 ml Dichtegradientenmedium und 0,1 ml 0,5 % (w/v) Phenolrot mischen.
   10. Tragen Sie mit einer Spritze und Nadel die Iodixanol-Gradientenlösung in die Polypropylen-Röhrchen in der Reihenfolge 5 ml 17 %, 5 ml 25 %, 5 ml 40 % und 5 ml 60 % auf, beginnend von unten. Geben Sie das gesamte aus Schritt 3.8 erhaltene Lysat (14–16 ml) auf den Gradienten. Der Gradient, von unten nach oben aufgelistet, besteht aus 60 %, 40 %, 25 %, 17 % und der Lysatschicht. Füllen Sie das Röhrchen mit Lysepuffer auf und verschließen Sie es mit einem Korken.
   11. Zentrifugieren Sie 90 Minuten bei 185.000 × g und 16 °C.
   12. Ernten Sie die virale Fraktion (40 %-Schicht) mit einer Spritze. Führen Sie die Nadel (21 Gauge) an der Grenzfläche zwischen der 40 %- und der 60 %-Fraktion ein und aspirieren Sie ausschließlich die 40 %-Schicht.
       HINWEIS: Vermeiden Sie das Aspirieren der 25 %-Schicht.
   13. Mischen Sie die virale Fraktion mit sterilisierter Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymer-PBS-Lösung (10 %-ige Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymer-Grundlösung 1:10.000 in PBS verdünnt) bis zu einem Gesamtvolumen von 15 ml. Geben Sie die Mischung in das Filterröhrchen (Cut-off MW = 100 kD). Zentrifugieren Sie 30 Minuten bei 2.000 × g und 4 °C.
   14. Entsorgen Sie die untere Flüssigkeit. Füllen Sie das Filterröhrchen erneut mit Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymer-PBS-Lösung bis zu einem Gesamtvolumen von 15 ml auf. Zentrifugieren Sie 20 Minuten bei 2.000 × g und 4 °C. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zweimal. Sammeln Sie das gereinigte rAAV9-Virus (die Fraktion oberhalb des Filters).
   15. Überführen Sie das gereinigte rAAV9 aus dem Filterröhrchen in 1,7-ml-Röhrchen. Portionieren Sie das gereinigte rAAV9 (100–400 µl/Röhrchen, je nach Volumen und Titer des AAV) und lagern Sie das Virus bei -80 °C.
       HINWEIS: Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Polyethylenimin, linear (MW 25.000)	Polysciences, Inc.	#23966-2
Röhrchen, Polypropylen, 36,2 ml, 25 x 87 mm, (Menge 56)	Beckman Coulter, Inc	# 362183
Nuklease, ultrarein	SIGMA	#E8263-25KU
Dichtegradientenmedium (Iodixanol)	SIGMA	#D1556-250ML
Zentrifugalfiltereinheit mit Ultracel-100-Membran	EMD Millipore Corporation	#UFC910008
Laborpipettiernadel mit stumpfen 90°-Enden, Maß 14, L 6 in., vernickelter Hubschrauber	SIGMA	#CAD7942-12EA
Poloxamer-188-Lösung (Pluronic® F-68-Lösung)	SIGMA	P5556-100ML
Proteinase K	SIGMA	3115828001
DNase I	Roche	10104159001
Zentrifugenmaschine	Thermo Scientific	75004260
Zentrifugensystem	Beckman Coulter	363118
Ultrazentrifuge	Beckman Coulter
DMEM-Medium	Fisher Scientific	SH30243FS
Fötales Rinderserum	Atlanta Biologicals	S11150
rAAV9-Vektor	Penn Vector Core	P1967