Immortalisierung von Endothelzellen durch retrovirale Transduktion viraler Onkogene

Zusammenfassung

Quelle: McAllister, S. C., Hanson, R. S., et al. Ein In-vitro-Modell zur Untersuchung der zellulären Transformation durch das Kaposi-Sarkom-Herpesvirus. J. Vis. Exp.(2017)

Dieses Video demonstriert die retrovirale Transduktion primärer endothelialer Zellen mit den HPV16-E6/E7-Onkogenen. Die integrierten Onkogene inaktivieren die Tumorsuppressoren p53 und Rb und verlängern dadurch die Zelllebensdauer. Die G418-Selektion bereichert transduzierte Zellen und ergibt immortalisierte endotheliale Kulturen, die für Transformationsstudien geeignet sind.

Protokoll

Transduktion von Endothelzellen (EC) mit E6- und E7-Papillomvirusgenen

HINWEIS: Wir verwenden routinemäßig Standard-Zellkulturgefäße zum Kultivieren primärer EZ. Sollte jedoch ein unzureichendes Wachstum der EZ beobachtet werden, sollte die Verwendung kommerzieller Kulturgefäße in Betracht gezogen werden.

1. Kultivieren Sie primäre humane dermale mikrovaskuläre oder lymphatische Endothelzellen (EC) in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂ in Endothelzell-Wachstumsmedium (EGM; enthält Basalmedium für Endothelzellen [EBM], ergänzt mit dem EGM-2 BulletKit [enthält fetalen Kälberserum, Hydrocortison, humanen Fibroblastenwachstumsfaktor-B, vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor, insulinähnlichen Wachstumsfaktor-1, Ascorbinsäure, humanen epidermalen Wachstumsfaktor, Antibiotika und Heparin]) in einem T75-Zellkulturkolben bis zu einer Konfluenz von etwa 50 %.
2. Kultivieren Sie für die Transduktion PA317 LXSN 16E6E7-Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂ in Dulbeccos modifiziertem Eagleschem Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fetalem Kälberserum und Antimikrobiellen, in einem T150-Zellkulturkolben, bis sie etwa 90 % konfluent sind. Inkubieren Sie anschließend über Nacht in 16 mL Medium.
3. Klären Sie das PA317-Medium durch Zentrifugation bei 300 × g für 5 min bei Raumtemperatur.
4. Entfernen Sie das EGM aus der EC-Kultur und überlagern Sie die Zellen mit 12 mL des geklärten PA317-Mediums und inkubieren Sie für 4 h.
   HINWEIS: Die Zentrifugation von 16 mL konditioniertem Medium bei 300 × g für 5 min führt zu einem kompakten Pellet, der durch die vorsichtige anschließende Entnahme von 12 mL geklärtem Überstand nicht gestört wird. Falls jedoch die Übertragung von PA317 LXSN 16E6E7-Zellen auf primäre EC-Kulturen problematisch ist (die Verpackungszelllinie wächst den EC schnell über), kann der konditionierte Überstand vor der Übertragung durch einen 0,45-µm-Filter filtriert werden.
5. Ersetzen Sie 6 mL des PA317-Mediums durch frisches EGM und inkubieren Sie über Nacht.
6. Füttern Sie die EC erneut mit 12 mL frischem EGM und inkubieren Sie weitere 48 h.
7. Um die EC zu unterkultivieren, entfernen Sie das Medium, waschen Sie mit 12 mL phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) ohne Kationen und geben Sie 3 mL einer kommerziellen enzymatischen Dissoziationslösung (z. B. TrypLE) hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C für 3 min.
8. Überführen Sie die Zellsuspension in ein kegelförmiges 15-mL-Röhrchen und zentrifugieren Sie bei 300 × g für 5 min bei Raumtemperatur. Resuspendieren Sie den resultierenden Zellpellet in frischem EGM und verteilen Sie ihn gleichmäßig auf 3 × T75-Kolben mit einem Endvolumen von jeweils 12 mL EGM pro Kolben.
9. Um EC auszuwählen, die mit E6 und E7 transduziert wurden, geben Sie G418 in einer Endkonzentration von 200 µg/mL für zwei Passagen hinzu, wonach die transduzierten EC für eine Infektion ausplattiert oder in flüssigem Stickstoff eingefroren werden können.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
BCBL-1-Zellen	NIH AIDS Reagent Program	3233
PA317-Zellen	ATCC	CRL-2203
Neonatale dermale mikrovaskuläre Endothelzellen	Lonza	CC-2505
EBM-2 Basal Medium	Lonza	CC-3156
EGM-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
RPMI
DMEM
PBS mit Calcium und Magnesium