Visualisierung und Größenbestimmung von Faustoviren mittels Elektronenmikroskopie

Zusammenfassung

Quelle: Bou Khalil, J. Y., et al. Eine schnelle Strategie zur Isolierung neuer Faustoviren aus Umweltproben unter Verwendung von Vermamoeba vermiformis. J. Vis. Exp. (2016).

Dieses Video zeigt die Abbildung von Faustovirus-Partikeln aus einer infizierten Amöbenkultur mittels Transmissionselektronenmikroskopie. Es behandelt die Probenvorbereitung auf dem Gitter, die negative Färbung mit Ammoniummolybdat zur Kontrastverbesserung und die Visualisierung des Virus im Mikroskop. Der Protokollabschnitt schließt mit der Bestimmung der Größe des Faustovirus mithilfe der integrierten Softwaretools des Mikroskops ab.

Protokoll

1. Elektronenmikroskopie
   1. Nach der ersten Identifizierung auf den Objektträgern überprüfen Sie das Vorhandensein des Riesenvirus durch elektronenmikroskopische Beobachtung der Überstände von Kulturen.
   2. Geben Sie 5 µl der positiven Probe auf das plasmabehandelte Gitter. Warten Sie etwa 20 Minuten bei Raumtemperatur.
   3. Trocknen Sie das Gitter vorsichtig ab und geben Sie einen kleinen Tropfen 1 %iger Ammoniummolybdatlösung darauf, 10 Sekunden lang. Lassen Sie das Gitter anschließend 5 Minuten trocknen.
   4. Führen Sie die Elektronenmikroskopie bei 200 keV durch.
   5. Platzieren Sie das Gitter auf dem Halter; führen Sie den Halter in das Mikroskop ein. Überprüfen Sie die Vakuumübersicht, indem Sie auf das entsprechende Symbol klicken. Schließen Sie die Ventile und beginnen Sie die Beobachtung mit einer Spotgröße 5 und einer Vergrößerung von x 25.000.
   6. Messen Sie das Riesenvirus mit ImageJ oder direkt am Mikroskop mithilfe des Messwerkzeugs des Mikroskops, das sich auf dem Aufnahmescreen befindet.
      HINWEIS: Klassifizieren Sie die Probe in die Faustovirus-Gruppe mit einer Kapsidgröße von etwa 200 nm.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Amöbenstamm CDC-19	ATCC	Frankreich	50237
Platten	Cellstar	Frankreich	655180
Vakuumangetriebene Filter	Thermo scientific	Frankreich	BPV4550 / 20170115
Phosphatgepufferte Salzlösung	Thermo Fisher scientific	Frankreich	10010-023
DAPI-Färbung	Life Technologies	Frankreich	D1306
Kohlegrids	Euromedex	Frankreich	FCF400NI
Ammoniummolybdat	VWR internationanl	Frankreich	21276185
Flaschen	SARSTEDT	Deutschland	833911
0,22 μm-Filter	Milex millipor	Frankreich	SE2M229104
Ultrazentrifuge Sorval WX 80	Thermo scientific	Frankreich	9102448
Schnellstromfilter	Nalgene	Frankreich	450-0020