Bestimmung der viralen RNA-Verteilung in Wirtszellen mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung

Zusammenfassung

Quelle: Vallery, T. K. & Steitz, J. A. Quantitative Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) und Immunfluoreszenz (IF) spezifischer Genprodukte in KSHV-infizierten Zellen. J. Vis. Exp. (2019)

In diesem Video wird die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung zur Visualisierung viraler RNA in virusinfizierten Zellen demonstriert. Es werden die Schritte der Sondenhybridisierung, Signalverstärkung und konfokalen Bildgebung erläutert.

Protokoll

1. Fixierung, Hybridisierung und Visualisierung viraler RNA

1. Entfernen Sie das Medium und überschüssige Zellen. Verwenden Sie im gesamten Protokoll Vakuumsaugung zum Entfernen von Lösungen und vorsichtiges Mikropipettieren zum Hinzufügen von Lösungen.
   HINWEIS: Die Stärke eines Vakuums kann verringert werden, indem man ein 200 µL Mikropipettenspitze über die Glas-Pasteurpipette. Ersetzen Sie die Mikropipettenspitze zwischen den Waschschritten, um Kontaminationen zu vermeiden. Jeder Waschschritt muss schnell durchgeführt werden, da es entscheidend ist, dass die Zellen niemals austrocknen.
2. Unmittelbar danach die Zellen mit vorab gekühltem 4% Formaldehyd/PBS (phosphatgepufferter Salzlösung) auf Eis für 30 min fixieren. Die Zellen dreimal mit 200 µL 1x PBS, abgekühlt auf 4 °C und 5 min bei Raumtemperatur oder auf Eis inkubieren.
   1. Permeabilisieren Sie die fixierten Zellen mit 200 µL 10 min lang auf Eis mit prägekühltem 0,5%igen Triton-X/PBS 750 µL von präkühltem 70%igem Ethanol bei 4 °C für 1 h (min) bis 7 d (max).
      HINWEIS: Alle Waschschritte in diesem Protokoll werden, sofern nicht anders angegeben, auf die gleiche Weise durchgeführt. 70 % Ethanol löst den Klebstoff zwischen den Kammerplatten und dem Objektträger und erleichtert die spätere Trennung; außerdem bietet es eine signifikante Unterbrechung im Protokollablauf. Dennoch sollte Paraffinfolie um die Kammerplatte gelegt werden, um Verdunstung zu vermindern, und der Ethanolspiegel in jeder Kammer etwa alle 8 Stunden überprüft werden. 70 % Ethanol glättet außerdem die Zellen und führt zu schärferen Bildern, während Triton-X die Zellen nicht dehydriert und somit die Zelldimensionen nicht verändert.
3. Entfernen Sie die Kammer vorsichtig, um zu verhindern, dass die Objektträgerplatte bricht.
   HINWEIS: Verwenden Sie ein neues Entferngerät oder eines mit sehr wenig zurückbleibendem Klebstoff, wie vom Hersteller bereitgestellt, und lösen Sie die Kammer vorsichtig ab, um Risse im Objektträger zu vermeiden. Die Verwendung von 70 %igem Ethanol als Permeabilisierungsreagenz für 4 h verringert die Wahrscheinlichkeit von Rissen erheblich. Falls ein Riss auftritt, setzen Sie das Protokoll mit den von dem Riss nicht betroffenen Kammern fort und beachten Sie die höhere Oxidationsrate unvollständig abgedichteter Objektträger (d. h. verkürzte Haltbarkeit bei Lagerung).
4. Waschen Sie die Zellen einmal mit 2x SSC (Salz-Natriumcitrat) und geben Sie dann 45 µL der Hybridisierungslösung bestehend aus 50 % Formamid, 10 % Dextran Sulfat, 2x SSC, 0,1 % bovinem Serumalbumin (BSA) 500 µg/mL Lachssperma-Desoxyribonukleinsäure (DNA), 125 µg/mL E. coli transfer-RNA (tRNA) und 1 mM Vanadylribonukleosid-Komplexe. 1 h bei 37 °C in einer Feuchtigkeitskammer, die aus einer 150-mm-Petrischale mit angefeuchteten sterilen Tüchern bestehen kann.
   HINWEIS: Bereiten Sie die Hybridisierungslösung frisch mindestens eine Stunde vor Gebrauch vor. Lösen Sie zunächst das Dextran Sulfat in Wasser unter häufigem Vortexen und inkubieren Sie in einem 37 °C Wasserbad
5. Berechnen Sie die Menge an Oligonukleotiden, die erforderlich ist, um die empfohlene Konzentration zu erreichen. 25 µM in 35 µL pro Kammer Hybridisierungslösung. Passe die Konzentration des Antisense-Oligonukleotids nach Bedarf an. Gib destilliertes Wasser zu den Oligonukleotiden hinzu, um das Denaturierungsvolumen zu erreichen 10 µL.
   HINWEIS: Nach der Markierungsreaktion werden die Oligonukleotide in der quenchenden Lösung enthaltend 0,18 M Kaliumcäcodylat, 23 mM Tris-HCl, 0,23 mg/mL BSA, 4,5 mM CoCl₂ bei 4 °C gelagert.₂, 18 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 2,7 mM Kaliumphosphat und 6,8 mM KCl, 45 µM 2-Mercaptoethanol, 0,02 % Triton X-100 und 2 % Glycerin. Die Konzentrationen sind ausreichend hoch, sodass eine Verdünnung mit Wasser die Denaturierungslösung auf Konzentrationen nahe 1x TE (10 mM Tris-HCl und 1 mM EDTA) bringt, einem Standardpuffer zur Denaturierung von Oligonukleotiden.
6. Denaturieren Sie die mit Digoxigenin (DIG) und/oder Alexa Fluor 594 markierten Oligonukleotide bei 95 °C 5 min lang. Dann hinzufügen 35 µL frische Hybridisierungslösung pro vorgesehenes Kammerobjektträger zu den denaturierten Oligonukleotiden. Bei der Durchführung einer doppelten Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) können beide Sätze an Antisense-Oligonukleotiden gemeinsam denaturiert und hybridisiert werden.
7. Entfernen Sie die Vorhybridisierungslösung und geben Sie dann die Hybridisierungslösung, die die markierten Oligonukleotide enthält, zu den Zellen hinzu. Inkubieren Sie über Nacht in der Feuchtekammer bei 37 °C mit Aluminiumfolie, um die mit Fluorophoren markierten Oligonukleotide zu schützen.
   HINWEIS: Die Inkubation sollte mindestens 10 h und höchstens 24 h betragen.
8. Am nächsten Tag die Zellen zweimal mit 2x SSC für jeweils 10 min waschen bei 37 °C und dann zweimal mit 1x SSC für 10 min bei 25 °C.
9. Fixieren Sie die Zellen mit vorab gekühltem 4% Formaldehyd/1x PBS für 10–15 min auf Eis. Anschließend waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS und permeabilisieren sie entweder 1 h mit vorab gekühltem 70% Ethanol oder 10 min mit vorab gekühltem 0,5% Triton-X/1x PBS bei 4 °C.
10. Inkubieren Sie die Zellen mit 1:200 Anti-Digoxigenin (DIG)–Fluoresceinisothiocyanat (FITC) in vorgekühltem 0,1 % BSA/1x PBS für 1 h bei 4 °CEntfernen Sie die Antikörperlösung und waschen Sie dreimal mit 1x PBS.
11. Fixierung mit vorgekühltem 4% Formaldehyd/1x PBS für 10–15 min bei 4 °C und dann dreimal mit 1x PBS waschen.
12. Inkubieren Sie die Zellen mit 0.4 µg/mL 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) in vorab gekühltem 0,5 % Triton-X/1x PBS für 15 min auf Eis und anschließend dreimal mit 1x PBS waschen.
13. Deckgläser mit fluoreszierenden Kügelchen (optional) und einem Eindeckmedium auf Objektträger aufbringen. Anschließend das Deckglas mit klarem Nagellack am Objektträger versiegeln.
14. Sammeln Sie mithilfe eines konfokalen Mikroskops innerhalb einer Stunde bis zu einer Woche nach Durchführung des Protokolls Bilder der Proben bei 630facher Vergrößerung. Tragen Sie mehrere Schichten Nagellack auf, um den Deckglaser zu versiegeln und die Lebensdauer der Fluorophore zu verlängern, indem Sie die Oxidationsrate verringern.
    HINWEIS: Verwenden Sie kein Montagemedium, das DAPI enthält. Schließen Sie beim Aufnehmen der Bilder einen Maßstabsbalken in jedes Bild ein, um eine spätere Quantifizierung zu ermöglichen. Fluoreszierende Kügelchen dienen als Kontrollen der Fluoreszenzintensität zwischen Objektträgern und Probenvorbereitungen. Nehmen Sie die Bilder im mittleren Abschnitt der Zelle auf, um eine zweidimensionale (2D) Quantifizierung durchzuführen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Anti-DIG FITC	Jackson Lab Immunologicals	200-092-156
Dextransulfat	Sigma Aldrich	D8906	Molekularbiologische Qualität
DIG-Oligonukleotid-Anhängeset	Sigma Roche	#03353583910	2. Generation
8-Kammerobjektträger	Nunc Lab Tek II	#154453	Blaue Dichtung fördert Oberflächenspannung, aber Trennung durch klare Gel-Dichtung ist ebenfalls verfügbar.
Formamid	Sigma Aldrich	F9037	Molekularbiologische Qualität
Vanadyl-Ribonukleosid-Komplexe	NEB	S1402S