Messung der spontanen Phageninduktion in lysogenen Bakterien über die Zeit

Zusammenfassung

Quelle: Krishnamurthi, R., et al. Untersuchung der Auswirkungen von temperenten Bakteriophagen auf ihre Lysogene mittels Transkriptomik. J. Vis. Exp. (2024).

Dieses Video demonstriert die zeitliche Zählung spontaner Phageninduktion in lysogenem Pseudomonas aeruginosa, indem lebensfähige Bakterienzellen (KBE) und infektiöse Phagenpartikel (Plaque-bildende Einheiten, PBE) über die Zeit quantifiziert werden. Durch die Entnahme von Proben zu definierten Zeitpunkten während des Wachstums sowie die Analyse von Kolonie- und Plaque-Bildung zeigt die Methode, wann die spontane Induktion minimal ist. Dies ermöglicht die Identifizierung optimaler Zeitpunkte für nachgeschaltete transkriptomische Analysen mit minimaler Störung durch lytische Vorgänge.

Protokoll

1. Zeitliche direkte Zählung der spontanen Induktion (Abbildung 1)

1. Stellen Sie Übernachtkulturen sowohl des Lysogens (z. B. P. aeruginosa PAO1-Lysogen, der LES (Liverpool Epidemic Strain (LES)-Bakteriophagen) trägt) als auch des Indikatorwirts (PAO1-Rif^R) (Rifampicin-resistente Pseudomonas aeruginosa PAO1) her, indem Sie eine einzelne Kolonie in 5 mL LB (Luria–Bertani-Bouillon) ansäen und 18–24 h bei 37 °C mit Schütteln bei 180 U/min inkubieren.
2. Stellen Sie frische Lysogen- und Indikatorwirtkulturen her, indem Sie die Übernachtkulturen im Verhältnis 1:100 in 100 mL LB ansäen und bei 37 °C mit Schütteln (180 U/min) inkubieren.
   1. Verfolgen Sie das Wachstum des Lysogens durch Messung der OD₆₀₀ und der Anzahl lebensfähiger Zellen mittels der Miles-Misra-Technik. Dazu entnehmen Sie ab dem Zeitpunkt der Inokulation jede Stunde über einen Zeitraum von 8 h je ein 1 mL-Probe aus jeder Lysogenkultur.
   2. Diluieren Sie die Probe unmittelbar nach der Entnahme seriell, indem Sie 100 µL der Probe in 900 µL des jeweiligen Mediums geben. Vortexen Sie gründlich mit maximaler Geschwindigkeit, entsorgen Sie die Pipettenspitze nach jeder Verdünnung und fahren Sie mit der Verdünnungsreihe von 10⁻¹ bis 10⁻⁹ fort.
   3. Geben Sie 10 µL der erforderlichen Verdünnungen tripelartig auf eine LB-Agarplatte, lassen Sie eintrocknen und inkubieren Sie 18–24 h bei 37 °C.

   4. Um die Anzahl lebensfähiger Bakterienzellen zu berechnen, wählen Sie eine Verdünnung mit leicht zählbaren Kolonien aus. Zählen Sie die Anzahl der Kolonien in jedem Spot und wenden Sie anschließend folgende Formel an:
       

      

      
      HINWEIS: Während die Lysogenkultur wächst, werden durch spontane Induktion aktive Phagenteilchen gebildet. Die Produktion infektiöser Phagen bedeutet, dass das Transkriptom der Lysogenpopulation nun durch genetische Expression kontaminiert ist, die mit dem lytischen Replikationszyklus assoziiert ist – sowohl durch das Signal der lytischen Phagenreplikation als auch durch die entsprechende Wirtsantwort der Zelle. Daher ist es wichtig, den Wachstumsstadium zu identifizieren, bei dem das Verhältnis von lysogenen Zellen zu freien infektiösen Phagenteilchen am höchsten ist, um die Hintergrundtranskriptionsgeräusche (verursacht durch das Transkriptom des lytischen Phagen) in den Datensätzen so gering wie möglich zu halten.

3. Um die Anzahl infektiöser Phagenteilchen in jeder zeitlichen Probe zu ermitteln, impfen Sie 5 mL steriles 0,4 %iges bakteriologisches Agar in LB (Top-Agar) mit 100 µL Indikatorwirt in mittlerer exponentieller Wachstumsphase (OD600: 0,4–0,5; in diesem Fall PAO1-Rif^R) unter Zusatz eines geeigneten selektiven Wirkstoffs (in diesem Fall 50 µg·mL⁻¹ Rifampicin, da die MIC des PAO1-Wirts nur 16 µg·mL⁻¹ beträgt)
   1. Geben Sie 10 µL der gleichen seriellen Verdünnung (siehe Schritt 1.2.2) auf die beimpfte Top-Agar-Schicht, lassen Sie eintrocknen und inkubieren anschließend 18–24 h bei 37 °C.

   2. Um die Anzahl infektiöser Phagenteilchen zu berechnen, wählen Sie eine Verdünnung mit leicht zählbaren Plaques aus. Zählen Sie die Anzahl der Plaques in jedem Spot.
       

      

   3. Ermitteln Sie den Zeitpunkt bzw. die Bedingung, bei der die spontane Induktion pro CFU (Koloniebildende Einheit) minimal ist, um diese für die weiteren experimentellen Schritte zu verwenden.

Ergebnisse

Abbildung 1: Der experimentelle Aufbau zur Zählung der PFU und CFU eines Lysogens aus derselben Probe.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
PAO1		6
LESB58		6
LES-Phagen	Induziert und aus LESB58 mittels Norfloxacin gereinigt.
Lysogeniebrühe (LB)	Merck	1.10285.500
LB-Agar	Merck	1.10283.500
Agar Agar	Fisher	A/1080/53
Top Agar	0,4 g Agar Agar + 2,5 g LB-Brühe in 100 mL Wasser; autoklavieren und verwenden.	-
Rifampicin	Sigma (Lagerlösung: 50 mg/mL in Methanol – gut mischen, zur Sterilisation durch eine 0,22-µm-Filtermembran filtrieren und bis zur Verwendung bei -20 °C lagern)	R3501