Dieses Video demonstriert die Induktion der lytischen Replikation in einem in das bakterielle Genom integrierten Prophage und die Erfassung von Genexpressionsänderungen durch zeitlich gestaffelte Probenahme für die transkriptomische Analyse.
Methodenartikel
Induktion der lytischen Prophagen-Replikation für die transkriptomische Analyse
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30. September 2026
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Protokoll
1. Herstellung von nicht induzierten und induzierten Lysogenkulturen zur RNA-(Ribonukleinsäure-)Extraktion
- Stellen Sie eine frische Übernachtkultur her, indem Sie eine einzelne Kolonie des Lysogens in 5 mL LB ansäen und 18–24 h bei 37 °C mit Schütteln (180 rpm (Umdrehungen pro Minute)) inkubieren.
- Subkultivieren Sie die Übernachtkultur im Verhältnis 1:100 in acht 250-mL-Flaschen mit jeweils 80 mL LB (Lysogeny broth).
- Beschriften Sie die erste Flasche als „nicht induziert“ und die übrigen als „induziert“ zusammen mit den Zeitpunkten, zu denen die Proben jeweils geerntet werden sollen (z. B. „induziert t = 0“, „induziert t = 10 min“, „induziert t = 20 min“ usw.; (Abbildung 1).
- Nach 90 min Inkubation, wenn die OD (optische Dichte) bei 600 nm zwischen 0,1 und 0,2 liegt oder zum Zeitpunkt minimaler spontaner Induktion (siehe Diskussion), geben Sie 4 µL 1 % Essigsäure (v/v) zur nicht induzierten Flasche hinzu (Abbildung 1).
HINWEIS: Da das Induktionsmittel in dieser Arbeit mit 1 % Essigsäure als Lösungsmittel hergestellt wurde, wurde zur Kontrolle die gleiche Menge Lösungsmittel allein zugegeben. Abhängig von der Herstellung unterschiedlicher Induktionsmittel können alternative Kontrollen in Betracht gezogen werden. - Geben Sie die 80 mL Kultur aus der nicht induzierten Flasche zu 720 mL steriler LB und fügen Sie unverzüglich die Stopplösung (eiskalte 5 % [v/v] Phenol, pH 4,3, 95 % [v/v] Ethanol) in einem Volumen hinzu, das 20 % des Kulturvolumens entspricht (160 mL), und inkubieren Sie mindestens 30 min, jedoch nicht länger als 2 h auf Eis, um die RNA-Transkripte zu stabilisieren. Dies ist die nicht induzierte Probe.
- Induzieren Sie die verbleibenden Kulturen in sieben 250-mL-Flaschen (Abbildung 1) mit der FMIC (endgültige minimale hemmende Konzentration) eines geeigneten Induktionsmittels (in diesem Fall 25 mg·mL−1 Norfloxacin, hergestellt in 1 % Essigsäure [w/v], endgültige Konzentration 1 µg·mL−1), mischen Sie gründlich und inkubieren Sie 1 h bei 37 °C mit Schütteln bei 180 rpm.
HINWEIS: Dieser Schritt zwingt die Lysogenkultur in einen stärker koordinierten Zustand lytischer Replikation. Die meisten Zellen in der Kultur beginnen mit der lytischen Produktion infektiöser Phagenteilchen. - Lassen Sie die Zellen regenerieren, indem Sie 80 mL Kultur aus der induzierten Flasche zu 720 mL steriler LB geben, wodurch das Induktionsmittel effektiv verdünnt wird. Ernten Sie die bakteriellen Zellen aus jeder Flasche alle 10 min ab Zeitpunkt 0 bis 1 h durch Zugabe der Stopplösung, wie in Schritt 1.5 beschrieben.
HINWEIS: Die Stopplösung stabilisiert die RNA bis zu 2 h. Um jedoch die Stabilität der Proben zu verbessern, führen Sie alle weiteren Schritte bei 4 °C durch. - Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 10.000 x g für 15 min bei 4 °C, so bald wie möglich, spätestens jedoch innerhalb von 2 h nach der Behandlung, um RNA-Abbau zu vermeiden.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die bakteriellen Pellets vorsichtig in der verbleibenden Flüssigkeit mit einer justierbaren automatischen Pipette, bevor Sie jede Probe in ein 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen überführen.
- Zentrifugieren Sie die Mikrozentrifugenröhrchen bei hoher Geschwindigkeit (13.000 x g) in einer Mikrozentrifuge bei 4 °C für 1 min und entfernen Sie den verbleibenden Überstand.
- Tiefgefrieren Sie die Pellets schnell, indem Sie jedes verschlossene Mikrozentrifugenröhrchen in flüssigen Stickstoff tauchen. Dies erleichtert die effiziente Lyse der Zellen für die RNA-Extraktion.
- Geben Sie TRIzol (1 mL) zu jedem gefrorenen Pellet und homogenisieren Sie die Suspension durch Pipettieren (nicht wirbeln). Lagern Sie bei −80 °C, bis die RNA-Extraktion für alle Proben durchgeführt wird.
HINWEIS: Das Protokoll kann an dieser Stelle unterbrochen werden. - Wiederholen Sie die Schritte 1.1–1.13 mit drei biologischen Wiederholungen.
Ergebnisse
Abbildung 1: Der experimentelle Aufbau zur Probenahme induzierter und nicht induzierter Kulturen zur RNA-Isolierung.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| LES-Phagen | Induziert und aus LESB58 mit Norfloxacin gereinigt. | Diese Studie | |
| Lysogeniebrühe (LB) | Merck | 1.10285.500 | |
| Lysogeniebrühe (LB)-Agar | Merck | 1.10283.500 | |
| Agar-Agar | Fisher | A/1080/53 | |
| Oberagar | 0,4 g Agar Agar + 2,5 g LB-Bouillon in 100 mL Wasser; autoklavieren und verwenden. | - | |
| Rifampicin | Sigma (Lagerlösung: 50 mg/mL in Methanol – gut mischen und verwenden) 0.22µm filtrieren, um es zu sterilisieren, und bei -20°C bis zur Verwendung | R3501 | |
| Eisessig | Fisher 1 % (v/v) in Wasser | 10060000 | |
| Norfloxacin | Sigma (Bestand: 25 mg/mL in 1 % Essigsäure [v/v]) – Gut mischen und verwenden 0.22µm filtern, um es zu sterilisieren, und bei -20°C bis zur Verwendung; um Freeze-Thaw-Zyklen zu vermeiden, in kleinen Aliquots lagern | N9890 | |
| Phenol, gesättigt mit Citratpuffer, pH 4,3 | Sigma | P-4682 | |
| Ethanol in Molekularbiologie-Qualität | Fisher | 16695992 | |
| TRIzol | Invitrogen | 12044977 | |
| Chloroform | Fisher | 11398187 | |
| Isopropanol | Fisher | 17150576 | |
| Nukleasefreies Wasser | Invitrogen | 10526945 |
